O antígeno CD34 é uma glicoproteína monomérica com aproximadamente 110kDa e é expressa em células progenitoras hematopoiéticas humanas, células endoteliais e fibroblastos embrionários. É o primeiro antígeno expresso na superfície celular que é encontrado em células progenitoras de todas as linhagens. Sendo assim, as células progenitoras hematopoiéticas CD34+ podem se diferenciar e restaurar a hematopoese de pacientes com mieloablação.
Essas células CD34+ podem ser estimuladas e mobilizadas da medula óssea para o sangue periférico através de drogas citotóxicas, citocinas ou pela combinação dos dois. O mais utilizado atualmente é o G-CSF (Granulocyte Colony-Stimulating Factor), que na maioria das vezes possibilita que as células CD34+ sejam colhidas em quantidades suficientes para realização do transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH).
Figura 1: Origem das células sanguíneas (TORTORA; DERRICKSON, 2010, p. 686)
O TCTH pode ser indicado em diversas situações, como em neoplasias hematológicas, hemopatias benignas, doenças autoimunes, doenças metabólicas e imunodeficiências primárias. Ele pode ser realizado através de sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) ou de sangue periférico (SP), que é dividido em algumas etapas, sendo elas:
- Mobilização: estímulo das células CD34+ através do G-CSF. Essa etapa leva aproximadamente entre 5 e 10 dias para obter o maior número de células-tronco na circulação sanguínea.
- Monitoramento: quantificação das células CD34+ para determinar o melhor momento para a coleta.
- Leucaférese: coleta das células-tronco hematopoiéticas através de equipamento de aférese que separa os diferentes componentes sanguíneos, retirando aquele de interesse e devolvendo os restantes ao doador. Esse procedimento leva em torno de 3 a 4 horas.
- Criopreservação: as células são congeladas e guardadas até o dia do transplante.
- Condicionamento: aplicação de quimioterapia ou radioterapia para supressão medular. Existem protocolos para cada tipo de doença, sendo o objetivo principal destruir eficazmente as células neoplásicas ou doentes.
- Descongelamento e transplante: processo realizado como uma transfusão sanguínea no próprio leito do paciente e leva de uma a duas horas.
A citometria de fluxo é um método rápido e eficaz para a etapa do monitoramento, já que consegue resultados em aproximadamente uma hora. Sendo assim, é o método de escolha para definir o melhor momento para a coleta das células CD34+.
Atualmente, o protocolo mais utilizado para realização do exame de quantificação de células CD34+ por citometria de fluxo é o ISHAGE (International Society of Hematotherapy and Graft Engineering), que foi estabelecido em 1995 pelo Prof. Dr. Robert Sutherland e colaboradores. Esse protocolo determina várias variáveis que devem ser observadas para o melhor resultado possível, visto que as células-tronco hematopoiéticas (CTH) estão presentes em quantidades muito baixas nas amostras, sendo assim uma análise de eventos raros.
Dentre as variáveis determinadas pelo protocolo ISHAGE estão: pipetagem reversa, utilização dos marcadores para identificação das células CD45+, CD34+ e o corante 7AAD (7-Aminoactinomycin D) para determinar a viabilidade celular. Além disso, ele determina números mínimos de eventos a serem adquiridos, tanto de leucócitos CD45+ quanto de CTH CD34+, para uma melhor análise de consistência do exame.
A contagem de células CD34+ pode ser realizada através de plataforma única ou plataforma dupla. Na plataforma única, adiciona-se microesferas fluorescentes (beads) com valor pré-definido por bula que permite o cálculo do valor absoluto das células CD34+ de acordo com a relação entre o número de esferas e o número de células CD34+ adquiridos. Já na plataforma dupla é utilizado o valor de leucócitos obtidos através de um contador hematológico. Sendo assim, utilizar a plataforma única faz com que haja menos possibilidade de erros e variáveis que a plataforma dupla.
Referências bibliográficas:
- Sutherland DR, Keeney M, Gratama JW. Enumeration of CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells. Curr Protoc Cytom. 2003 Aug;Chapter 6:Unit 6.4. doi: 10.1002/0471142956.cy0604s25. PMID: 18770780.
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