Autoras: Helena Varela de Araújo, Margareth Fernandes, Rafaele Loureiro Azevedo e Bruna Garcia Nogueira
Desde o início da citometria de fluxo, décadas atrás, os avanços tecnológicos têm concentrado-se predominantemente em refinar e simplificar o uso de esquemas ópticos existentes. Embora úteis para a comunidade científica, os citômetros convencionais apresentam certa dificuldade de aumentar a dimensionalidade dos dados para cada amostra.
Os citômetros de fluxo convencionais utilizam filtros de passagem de banda e detectores de luz para capturar o pico de emissão de fluorescência, tendo um único detector e filtro dedicados para cada fluorocromo, necessitando da compensação para eliminar a sobreposição de fluorocromos vizinhos.
A citometria fluxo espectral, por sua vez, demonstrada pela primeira vez pelo Dr. Paul Robinson na Universidade de Purdue em 2004 (Robinson, 2004), captura o espectro de emissão de fluorescência em toda a faixa de comprimento de onda de luz visível.
O primeiro citômetro de fluxo espectral foi lançado pela Sony Biotechnology em 2012, utilizando prismas com detectores PMT para coletar e amplificar luz além da capacidade dos citômetros de fluxo convencionais.
Em 2017, a Cytek Biosciences apresentou o Citômetro de Fluxo de Espectro Total (Full Spectrum Flow Cytometry – FSFC) Cytek® Aurora com várias melhorias no sistema de fluidos e óptica de excitação e emissão. A singularidade da tecnologia de citometria de fluxo de espectro total dos equipamentos da Cytek está no design óptico onde, utiliza detectores de semicondutores aprimorados e na análise computacional para medição espectral completa de vários fluorocromos que emitem sinais luminosos com comprimento de onda na faixa de 360-830 nm. Cada laser possui uma matriz de detectores e cada matriz tem conjunto de detectores, tecnologia chamada de Divisores Seletivos de Vários Comprimentos de Onda (CWDM), montados em diversos arranjos e fotodiodos de avalanche (APDs) para coletar luz e convertê-la em sinais elétricos. Fig1
Os APDs têm baixo ruído eletrônico e alta eficiência quântica, especialmente em comprimentos de onda mais altos com um alcance dinâmico adequado para muitas aplicações de fluxo. Isso se traduz em seus sinais negativos sendo baixos e apertados e seus sinais positivos sendo mais brilhantes.
Nos citômetros de fluxo de espectro total, cada fluorocromo possui uma assinatura espectral única que o identifica. Assim, mesmo fluorocromos altamente sobrepostos podem ser usados no mesmo painel, o que aumenta a flexibilidade no desenho de painéis multicoloridos complexos para análise imunofenotípica por citometria de fluxo. Fig.1
Por fim, podemos citar os benefícios da citometria de fluxo de espectro total:
- Maior flexibilidade na escolha dos fluorocromos para montar painéis multicoloridos.
- Captura da autofluorescência de qualquer amostra altamente fluorescente, e remoção dessa autofluorescência dos dados, permitindo melhor visualização das células de interesse e análise dos resultados.
- O citômetro de fluxo espectral requer menos lasers para a análise de mais cores.
- É ideal para caracterização de populações de baixa frequência e amostras com baixo número de células, analisando milhões de células em menos tempo.
Figura1. Diagrama de citometria de fluxo espectral completo: A luz emitida pela amostra é coletada e passada por múltiplos arranjos ópticos, uma metodologia chamada Divisão Seletiva de Múltiplos Comprimentos de Onda (CWDM) presente nos citômetros Cytek® Aurora™ e Northern Lights™. Cada laser possui uma matriz de detectores e cada matriz tem conjunto de detectores, (CWDM) montados em vários arranjos e fotodiodos de avalanche (APDs). A Citometria de Fluxo de espectro total captura todo o espectro de emissão de cada molécula fluorescente em uma faixa definida de comprimentos de onda, usando detectores de luz altamente sensíveis. Cada fluorocromo possui uma assinatura espectral única que o identifica e permite a caracterização de alto rendimento de mais de 40 parâmetros em um único nível de célula de uma amostra. Os Citômetros de Fluxo da Cytek® Aurora™ e Northen lights™ podem ser equipados com 3 a 5 lasers (até 67 parâmetros) e 1 a 3 lasers (43 parâmetros), respectivamente.
Dessa maneira, a citometria de espectro completo possibilita maior rendimento na análise multiparamétrica, em um único tudo, de até 40 parâmetros para a caracterização de células isoladas em suspensão. Esta tecnologia combina alta sensibilidade, capacitando novas aplicações com maior flexibilidade para a escolha de marcadores e melhor resolução. Como mais marcadores podem ser avaliados simultaneamente, a citometria espectral auxilia a solucionar os problemas de amostragem limitada, aumentando a quantidade das informações e trazendo maior resolução para as análises.
Referência
Bonilla, D. L. Bonilla, Reinin,G and Chua, E. Full Spectrum Flow Cytometry as a Powerful Technology for Cancer Immunotherapy, from Front. Mol. Biosci., 29 January 2021 | https://doi.org/10.3389/fmolb.2020.612801
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