Efeito da duração da impregnação em parafina do material histológico na marcação imunohistoquímica

Resumo: A impregnação é uma importante etapa da técnica histológica que consiste em embeber o material histológico previamente fixado, desidratado e diafanizado no meio de inclusão (e.g. parafina). Sabendo que é importante analisar os efeitos da exposição dos tecidos a temperaturas superiores a 60ºC por longos períodos de tempo, de modo a evitar danos nos antigénios, tomou-se, como objetivo deste trabalho, estudar os efeitos da duração da impregnação na técnica imunohistoquímica (IHQ).

Selecionaram-se 10 amostras de apêndice íleo-cecal humano fixadas em Formol a 10% Neutro Tamponado das quais se recolheram 30 fragmentos que foram submetidos a processamento histológico com recurso a parafina a 64ºC, com durações de 30, 60 e 300 minutos no processador Tissue-Tek® Xpress® 120x. A IHQ foi efetuada pelo método de polímero indireto recorrendo aos soros primários anti: CD79α; Citoqueratinas (clone MNF116); proteína S100 e Ki-67. Os resultados foram observados microscopicamente e classificados numa escala 0-100, segundo os parâmetros preservação morfológica celular, quantidade de estruturas marcadas, intensidade de marcação, fundo e marcação inespecífica. No tratamento estatístico recorreu-se ao teste não paramétrico de Kruskal-Wallis (alfa=0,05).

Os casos submetidos a 30 minutos de impregnação obtiveram classificações que se caracterizam por um par média/desvio padrão de 89,58/10,45, enquanto os de 60 minutos obtiveram 90,57/9,85 e os de 300 minutos obtiveram 89,94/10,84. O teste de Kruskal-Wallis demonstrou que não existe qualquer evidência estatística de diferenças entre as durações estudadas. Este resultado contraria o publicado por outros autores que encontraram diferenças após 1 e 8 horas de impregnação. No entanto, estes autores não recorreram a recuperação antigénica otimizada na técnica de IHQ, o que pode ter condicionado os resultados obtidos. Conclui-se que, para os anticorpos analisados, não existem diferenças na qualidade da imunomarcação consoante a duração da impregnação, de 30 minutos até 5 horas.

Palavras-chave: Impregnação histológica, Imunohistoquímica.


Abstract: Tissue impregnation is an important step of the histological technique which consists in embedding in a wax material (e.g. paraffin) histological tissue previously fixed, dehydrated and diaphanizated. Knowing that is important to analyse tissue exposure to higher temperatures than 60ºC for long periods of time in order to avoid antigen damage, became, as an objective of this study, to investigate impregnation duration effects in immunohistochemistry (IHC).

10 samples of human appendix fixed in 10% neutral buffered formalin were selected and 30 fragments were collected and submitted to histological technique with a 64ºC paraffin impregnation and durations of 30, 60 and 300 minutes in Tissue-Tek® Xpress® 120x processor. IHC was performed with Polymer methods using primary antibodies anti: CD79α; Cytokeratin (clone MNF116); S100 protein and Ki-67. Results were observed under light microscope and classified on a 0-100 scale, according to cellular morphologic preservation, quantity of stained structures, staining intensity, background and nonspecific staining parameters. For statistical treatment non parametric Kruskal-Wallis test (alpha=0,05) was used.

The samples with 30 minutes impregnation achieved classifications characterized by a mean/standard deviation of 89,58/10,45, whereas 60 minutes cases received 90,57/10,45 and 300 minutes cases received 89,94/10,45. Kruskal-Wallis test showed that there is no statistical evidence of differences between the studied durations. This result oppose the published by others authors that found differences after 1 and 8 hours impregnation. However, these authors did not use optimized antigen retrieval methods in the IHC technique, which may have conditioned the obtained results. In conclusion, for the analysed antibodies, there are no differences depending on impregnation duration, from 30 minutes to 5 hours.

Keywords: Tissue Impregnation, Immunohistochemistry.


Autores: Paulo Alexandre, Lara Castanheira, Teresa Ferreira e Amadeu Borges-Ferro


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