A validação analítica é um processo imprescindível para qualquer implantação de um novo equipamento analítico, teste e/ou metodologia a ser processada em um laboratório. Nos permite uma completa análise considerando diferentes amostras, equipamentos de medição, ensaio, métodos e quaisquer outras possíveis fontes de variação dos processos analíticos. Desta forma, asseguramos a confiança dos ensaios realizados quanto aos resultados obtidos.
O objetivo de uma validação é demonstrar ensaios exatos, precisos, estáveis, reprodutíveis e flexíveis para uma faixa específica de uma substância que se espera identificar ou quantificar. Em suma, esta validação significa que iremos garantir que as análises reproduzam valores consistentes se comparadas a um valor de referência.
Antes do início de uma validação, é preciso haver um bom planejamento, começando pela segregação das amostras:
Selecione amostras biológicas íntegras: com volume suficiente, livre de hemólise, lipemia, fibrinas e, nossa sugestão é que não sejam de pacientes internados (pois sofrem muita interferência de medicamentos). Utilizem amostras conhecidas com resultados baixos, normais e altos do analito que deseja validar e se não for possível, faça um pool de amostras aleatórias e envie para comparabilidade em laboratório de Apoio. Se atentem sempre a estabilidade das mesmas frente ao exame que pretende validar.
Para exames qualitativos, segregue Reagentes e não Reagentes, Positivos e Negativos. E no caso de Classificação sanguínea, segregue amostras aleatórias. Exames de Coagulação, Hemograma, Microbiologia e Urina, sugerimos utilizar amostras do dia.
EXECUTANDO A VALIDAÇÃO:
– Segundo o protocolo do Colégio Americano de Patologia Clínica (CAP), a indicação é que a validação de cada analito seja realizada em 60 ensaios (20 resultados baixos, 20 normais e 20 altos).
Etapas:
De acordo com as referências pesquisadas, as etapas a seguir são:
- Precisão Intraensaio (Repetibilidade):
A repetibilidade de resultados corresponde à concordância entre resultados de sucessivas medidas do mesmo analito, obtidos sob as mesmas condições de medida. Serão analisadas 10 alíquotas, sequencialmente, de valores baixos, normal e elevado, em dois períodos distintos, manhã e tarde, de um único dia.
- Precisão Interensaio (Reprodutibilidade):
A reprodutibilidade é a maior diferença, no nível de confiança de 95%, que pode ocorrer em resultados obtidos em condições de reprodutibilidade, ou seja, analistas diferentes, instrumentos diferentes ou até laboratórios diferentes.
Diferente da Repetibilidade a Reprodutibilidade é a precisão do ensaio em condições mais variadas e pode ser obtida através de um intralaboratorial, onde analistas diversos farão os testes em dias diferentes.
A reprodutibilidade é a maior diferença, no nível de confiança de 95%, que pode ocorrer em resultados obtidos em condições de reprodutibilidade.
- Sensibilidade Analítica:
É a capacidade do método de distinguir, com confiança, concentrações mínimas.
Para o estabelecimento da sensibilidade analítica, serão realizadas 4 diluições (1:2; 1:5; 1:10 e 1:20) de uma amostra de valor baixo. De cada uma das diluições, serão realizadas 10 determinações. A sensibilidade analítica será definida como sendo o valor de maior diluição da amostra que apresente resultados reprodutivos, ou seja, que apresente o menor valor de CV entre os resultados e cujo valor de CV seja inferior ao CV aceitável para o analito.
- Linearidade Analítica:
É a capacidade do método em gerar resultados linearmente proporcionais à concentração do analito, dentro de uma faixa analítica especificada. Para o estabelecimento da linearidade analítica, serão realizadas 4 diluições (1:2; 1:5; 1:10 e 1:20) de uma amostra de valor elevado, acima da linearidade preconizada pelo fabricante. De cada uma das diluições, serão realizadas 10 determinações. A linearidade analítica será definida como sendo a menor diluição da amostra que apresente resultados reprodutivos, ou seja, que apresente o menor valor de CV entre os resultados e cujo valor de CV seja inferior ao CV aceitável para o analito.
- Verificação da Linearidade e Acurácia:
Para a verificação da linearidade e acurácia, serão selecionadas duas amostras, uma de valor baixo, próximo à sensibilidade do método e outra de valor elevado, próximo à linearidade do método. Serão feitas diluições sequenciais das amostras, de acordo com a tabela abaixo, as quais serão processadas em triplicata e das quais se obterá um valor médio.
Amostra Diluição Valores Teóricos Esperados
D1 Amostra baixa pura Concentração conhecida da amostra
D2 4 partes da amostra baixa e 1 parte da amostra alta (4 x D1) + (1 x D6)/5
D3 3 partes da amostra baixa e 2 partes da amostra alta (3 x D1) + (2 x D6)/5
D4 2 partes da amostra baixa e 3 partes da amostra alta (2 x D1) + (3 x D6)/5
D5 1 parte da amostra baixa e 4 partes da amostra alta ((1 x D1) + (4 x D6)/5
D6 Amostra alta pura Concentração conhecida da amostra
Onde: D 1- D6 correspondem às diferentes diluições.
AMR/CRR:
O Intervalo Analítico de Medidas (AMR) é definido como o intervalo de concentração no qual a quantificação da amostra é realizada sem qualquer modificação (diluição ou concentração).
O Intervalo de Relato Clínico (CRR) estabelece quais as diluições máximas aplicáveis a cada analito.
O estabelecimento do AMR e do CRR se dará através dos resultados obtidos nos estudos para o estabelecimento da sensibilidade e da linearidade.
- Carryover:
É o carreamento de resíduo de um ensaio inicial que pode ser levado a outra reação, contaminando o teste imediatamente seguinte, representando um possível erro analítico. Para compreender esta fonte de erro nos sistemas analíticos e garantir que eles estão dentro dos limites permitidos deve-se cumprir um protocolo de inspeções e verificações periódicas.
No estudo do carryover serão utilizadas 10 alíquotas de uma amostra com concentração de valor conhecido baixo(B) e 10 alíquotas de uma amostra com valor conhecido alto(A), estas amostras serão analisadas sequencialmente:
1- Três amostras baixas
2- Duas amostras altas
3- Uma amostra baixa
4- Duas amostras altas
5- Quatro amostras baixas
6- Duas amostras altas
7- Uma amostra baixa
8- Duas amostras altas
9- Uma amostra baixa
10- Duas amostras altas
Calculam-se as médias das concentrações de todas as amostras baixas analisadas após uma amostra baixa (B-B) e a média das concentrações baixas após amostra alta (A-B). É ainda calculado o DP das leituras B-B e o carreamento é obtido pela diferença entre as médias de B-B e A-B.
Como critério de aceitação adota-se um carreamento de até três desvios padrões das leituras B-B.
- Robustez:
É a capacidade do método em resistir a pequenas e deliberadas variações nas condições analíticas como: condições ambientais, fator humano, variações entre lotes de reagentes ou materiais empregados. O estudo de robustez será realizado com a análise de 10 amostras em duplicata por três operadores diferentes
Uma das etapas de Validação é a CORRELAÇÃO CLÍNICA (Valor Diagnóstico) – Análise aplicada para ensaios de comparabilidade quantitativa ou qualitativa.
Estes resultados são analisados em comparação a Correlação clínica estabelecida entre os resultados dos Analitos em comparabilidade para validação de exames, métodos, kit, equipamentos e lotes, sendo que os resultados correlacionados precisam apresentar o mesmo Valor Diagnóstico e demonstrar conformidade acima do estabelecido para a liberação na produção.
A sua validação inicial neste caso, deve demonstrar na tabela se os resultados constam dentro da normalidade ou se representam alterações clínicas.
O cálculo é feito através da subtração do resultado do equipamento a ser validado com o resultado do equipamento vigente. A Correlação numérica entre resultados obtidos para ensaios de Comparabilidade Quantitativas, deve estar dentro das Normas preconizadas pela ANVISA e INMETRO:
Segue exemplo da planilha de Validação inicial:
CONFIRA A PLANILHA EM NOSSA REVISTA DIGITAL AQUI
CORRELAÇÃO CLÍNICA (Valor Diagnóstico) – Análise aplicada para ensaios de comparabilidade Qualitativa:
Os resultados correlacionados precisam apresentar o mesmo Valor Diagnóstico e demonstrar conformidade acima do estabelecido para a liberação na produção.
Demonstrar na tabela se os resultados constam dentro da normalidade ou se representam alterações clínicas.
Para as comparabilidades Qualitativas, utilizar o padrão de Conforme/ Não conforme.
Antes ou após a validação do analito, deve-se imediatamente cadastrar uma amostra Teste – e acompanhá-la até a liberação clínica do laudo. Conferir exames que precisam de cálculo, verificar valor de referência e unidades de medida.
Imprimir e arquivar datado e assinado pela Garantia da Qualidade, Responsável Técnico e Tecnologia da Informação (TI). Assegurando assim que o exame será reproduzido e Inter faceado de ponta a ponta.
Guardar os dados da validação por cinco anos de forma rastreável.
E em caso de implantação, como proceder?
– Verifique se há câmara fria e/ou geladeiras para guarda de amostras biológicas e outra para guarda de insumos.
-Certifique-se que há fornecimento elétrico que suporte Ar condicionado, todos os equipamentos ligados e sistema de água com autonomias suficientes no local.
– Faça um pedido de insumos que contemple o suficiente para a validação (multiplique o número de testes estimados que fará pelo número de ensaios de cada kit), espelhamento de equipamentos (backup) e primeiro mês de rotina. Estes itens devem conter o quarteto indispensável para cada analito: Reagente, Calibrador, Controle e consumíveis.
Se certifique que os itens acima são compatíveis com a máquina que irá validar.
– Todas as máquinas devem ter a capacidade de emitirem dados brutos – seja impresso, via sistema ou pen drive.
POR:
Fábia Bezerra, Biomédica, Gerente Nacional de Qualidade da Hapvida Diagnósticos
Mariana M. Zanotto de Araújo, Biomédica, Supervisora da Qualidade do Grupo São Francisco/Hapvida Diagnósticos.
REFERÊNCIAS:
. Brasil, Agência Nacional de Vigilância Sanitária; Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 2003, Diário Oficial da União, 02/06/2003.
. Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial; DOQ-CGCRE-008, Orientações sobre Validação de Métodos de Ensaios Químicos, março, 2003.
Swartz, M. E.; Krull, I. S.; Pharm. Technol. 1998, 2012.
Green, J. M.; Anal. Chem. 1996, 68, 305A.
. CLSI GP29-A Métodos alternativos de controle de Qualidade
. RDC 302 – Regulamento Técnico para funcionamento de Laboratórios Clínicos
.Westgard Variação Biológica e especificações de Qualidade Analítca
.www.westgard.com/biodatabase1.htm
. CLIA Proficiency testing criteria for acceptable analytical performance
.www.westgard.com/clia.htm
. https://www.cap.org/