Métodos de RT-qPCR automatizados com Equipamentos de Pipetagem Echo 525, de alto rendimento e baixo custo para testagem de vigilância e identificação de SARS-CoV-2

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“O Equipamento de Pipetagem Echo 525 tem sido uma parte essencial de nosso laboratório para testagem de vigilância de SARS-CoV-2. Em uma comparação recente, descobrimos que o Echo 525, que dispensa o uso de ponteiras (tip-less)  e é livre de contato durantes as transferencias, fornece dados muito confiáveis e sensíveis para o prepraro de reações de RT-qPCR a 5 µL em faixa de concentração de 2,1-200 cópias /µL.”

Dr. Andrea Crisanti, Professor de Microbiologia da Universidade de Pádua

 

Introdução

A descoberta da doença do coronavírus 2019 (COVID-19), também conhecida como SARS-CoV-2, em Wuhan,China, levantou um alerta público global ¹. Este vírus mortal e altamente infeccioso fez com que o mundo tomasse medidas sérias, visto que o número de casos confirmados tem aumentado continuamente desde que foi relatado o primeiro caso. O governo chinês alertou que são necessários esforços internacionais para superar esse surto. A professora Andrea Crisanti ², da Universidade de Pádua, respondeu imediatamente a essa pandemia iniciando um método de RT-qPCR de alto rendimento, automatizado e de baixo custo para testar milhares de amostras de RNA a partir de swabs na área do Veneto, no norte da Itália.

 

 

 

 

O Echo 525 é um equipamento de trasnferência de líquidos e pipetagem automática acústico que dispensa ponteiras (tipless) da Beckman Coulter Life Sciences e tem sido uma parte essencial desses estudos econômicos e de alto rendimento. Com alta precisão e exatidão o Echo 525 até 25 nL permitiu que os ensaios de RT-qPCR fossem realizados com sucesso em volumes reduzidos de 5 µL em placas de formato de 384 poços em vez de 25 µL em placas de 96 poços. Para a reação de 5 µL, utilizou-se 1 µL de amostra extraída de RNA de swabs nasais e 4 µL de pré mix de RT-qPCR, incluindo os primers e sondas. A redução de volume de reação de RT-qPCR tem sido essencial para se utilizar menos reagente mas manter um alto nível de detecção (LoD) de 2,1 cópias/µL para uma única amostra.

 

 

 

 

 

Ácidos nucleicos totais foram purificados a partir de 200 μL de amostras de swab nasofaríngeo e eluídos em um volume final de 100 μL usando um Sistema MagNA Pure 96. Realizou-se a detecção de RNA de SARS-CoV-2 por um método in house de PCR em tempo real, que foi desenvolvido de acordo com o protocolo, primers e sondas projetadas por Corman et al.³  visando os genes de RNA polimerase dependente de RNA e envelope (E) (E_Sarbeco_F, E_Sarbeco_R, E_Sarbeco_P1) de SARS-CoV-2 (RdRp: RdRp_SARSr-F, RdRp_SARSr-R, RdRP_SARSr-P1 e RdRp_SARSr-P2).

 

Figura 1. Fluxo de trabalho da análise de carga viral de RNA no laboratório do Prof. Crisanti

 

Usando-se este método, o grupo foi capaz de estudar até 5.000 amostras por dia com tempo de retorno rápido de 15 minutos contra 3 horas para a configuração de reação. Além disso, como o Echo é uma tecnologia acústica que não emprega ponteiras, isso reduz o uso de ponteiras descartáveis, o que é extremamente importante devido à alta demanda por ponteiras durante a pandemia de SARS-CoV-2.

 

“Em nossas mãos, o Echo permitiu reduzir o tempo de retorno e tempo de manipulação em 92% e 75%, respectivamente; e diminuiu o custo de reagente para RT-qPCR em 80%. Além disso, o fato de não se usar ponteiras de plástico foi um divisor de águas em nosso laboratório quando as ponteiras estão em grande demanda devido à pandemia.” Dr. Andrea Crisanti, Professor de Microbiologia na Universidade de Pádua

 

 

Testes de comparação entre o equipamento Echo 525 e equipamento de transferência de líquidos automático que utiliza ponteiras

Foram testadas sete amostras de RNA de baixa concentração de extratos de swab nasal, em 10 repetições no Echo 525 e um pipetador automático utilizando ponteiras.

 

Tabela 1. Comparação de valores de Ct entre reações de RT-qPCR com configuração usando 2 métodos diferentes a 25 e 5 µL.

 

O mesmo tipo de comparação entre os dois equipamentos de pipetagem automática foi estendido para quatro placas de 96 poços em equipamento utilizando ponteiras (25 µL) versus Echo 525 com amostras de 384 poços (5 µL).Também foram incluídas quatro amostras de controle positivo (RNA de Ribonuclease P humana) e 25 amostras em branco. Os dados da comparação do valor de Ct apresentaram o seguinte resultado:

• 327 amostras sem carga viral de RNA nos dois sistemas
• 15 amostras com carga viral de RNA semelhantes nos dois sistemas, com Ct variando entre 17 e 35
• 13 amostras exibindo carga viral somente quando analisadas com o instrumento Echo 525 em placas de 384 poços e com termociclador QuantStudio 5. Dessas 13 amostras:

– Oito amostras foram confirmadas como tendo carga viral usando-se outros métodos.
– Cinco amostras não foram monitoradas.

 

A comparação de dois conjuntos de dados demonstra que configurar as reações de RT-qPCR em 5 µL, usando o Echo 525 em placas de 384 poços não causa nenhuma perda de identificação de amostras com carga viral.

A comparação do LoD entre as reações de 25 e de 5 µL demonstrou:

• 0,82 cópias/µL para reação de 25 µL em placa PCR de 96 poços e termociclador 7900HT Fast Real-Time com input de 5µl de amostra de RNA extraído.
• 2,1 cópias/µL para reação de 5 µL em placa PCR de 384 poços e termociclador QuantStudio 5 com1 µL de input de amostra de RNA extraído.

 

O LoD foi avaliado testando 32 replicatas em 10 diferentes concentrações de amostras de RNA com mais de 95% de positividade.

A sensibilidade do ensaio foi aperfeiçoada usando o Echo 525 para configurar a reação de 5 µL em placa de 384 poços e QuantStudio 5, em comparação com o uso de um pipetador automático utilizando ponteiras descartáveis para configurar uma reação de 25 µL em placa de PCR de 96 poços e 7900HT PCR Fast Real-Time. Esse resultado também pode ser atribuído à combinação do uso de um termociclador diferente com melhor transferência de calor para volumes menores.

 

Figura 2. Curvas de amplificação para amostras de uma placa de 384 poços, com 2 controles positivos (destaque em verde) e uma amostra positiva (destaque em amarelo), e as amostras negativas ou controles negativos (curvas em azul de linha de base).

 

 

Resumo

O aperfeiçoamento dos testes de vigilância e a detecção precoce da transmissão do SARS-CoV-2 em locais que ainda não foram afetados pelo vírus são fundamentais para controlar sua propagação e reduzir a substancial carga na saúde pública, econômica e social imposta pela COVID-19 em todo o mundo.

Equipamentos como o Echo 525 permitem aplicações rápidas, econômicas e de alto rendimento, como estes estudos populacionais, tornando-os menos trabalhosos e reduzindo os volumes de reagentes e, portanto, o custo. Além disso, a tecnologia que dispensa ponteiras permite programas de testes mais sustentáveis e reduz ainda mais os custos, reduzindo o número de ponteiras descartáveis usadas em  cada fluxo de trabalho.

 

A redução dos volumes de reação e o aumento da velocidade de configuração de reação usando o equipamento Echo também pode permitir uma escala maior nos testes de ~1.300 amostras/dia para até ~5.000 amostras/dia.

 

Destaques

No laboratório do Professor Crisanti, o método padrão antes de ter um Pipetador Automático Echo 525 consistia em usar um Pipetador Automatico com uso de ponteiras descartáveis e uma placa de 96 poços em conjuneto com Sistema de PCR 7900HT Fast Real-Time. O Echo 525 foi adicionado ao laboratório para tornar mais enxuta a configuração das reações de RT-qPCR pós-extração usando placa de 384 poços em conjunto com o QuantStudio 5 Real-Time PCR.

 

As vantagens do fluxo de trabalho permitido pelo Echo no laboratório incluem:

• Redução do tempo de manipulação: 75% mais rápido no Echo (de 8 horas para 2 horas)
• Redução do custo do reagente: 80% de economia (de 25 µL RT-qPCR para 5 µL)
• Tempo de retorno mais rápido: tempo 92% mais rápido da amostra até os dados (de 3 horas para 15 minutos)
• Diminuição do consumo de ponteiras de plástico, contribuindo com a sustentabilidade e evitando problemas com a cadeia de suprimento de ponteiras
• Baixa manutenção: Usuários não precisam fazer calibração de líquido nem manutenção demorada
• Fácil de usar: A plataforma e o software do Echo são fáceis de usar e operar.
• Necessidade de menos termocicladores: Passando de placas de 96 poços para 384 poços, são necessárias menos termocicladores, o que também é importante devido à alta demanda por termocicladores de 96 poços durante a pandemia

 

 

Referências

 

1. World Health Organization. Novel Coronavirus (COVID-19) Situation.who.int (2020)
2. Crisanti. A. et al. Suppression of COVID-19 outbreak in the municipality of Vò, Italy. medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.17.20053157v1

3. V.M. et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Eurosurveillance Vol. 25 doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045 (2020)