Por: Helena Varela de Araújo, Rafaele Loureiro e Bruna Garcia
Introdução
A citometria de fluxo é uma técnica laboratorial capaz de analisar, de maneira multiparamétrica, qualquer material que esteja em suspensão em meio líquido, principalmente células. Entre suas aplicações, podemos destacar a caracterização fenotípica, análise do ciclo celular, análise de viabilidade celular/apoptose e citotoxicidade.
A história da técnica começa em 1934, quando Moldovan descreveu um princípio eletrostático para quantificação de células.(1) Crosland-Taylor, em 1940, desenvolveu um contador celular com fluxo contínuo de líquido, com dispersão de luz e iluminação em campo escuro.(1) Em 1957, Wallace Coulter desenvolveu o primeiro contador eletrônico de células, capaz de contar hemácias e leucócitos.(1) Mais tarde, o aparelho de Coulter foi aprimorado sendo capaz de também mensurar o tamanho das células.(1)
Na década de 60, Mack J. Fulwyler desenvolveu um separador de células (cell sorter) usando os princípios do equipamento de Coulter, porém sendo capaz de separar populações e desviá-las eletrostaticamente.(1) Daí em diante, os equipamentos foram ficando cada vez mais robustos e modernos, até que chegassem aos citômetros comerciais de hoje.
No Brasil, a citometria de fluxo começou em 1988 com a chegada do primeiro citômetro de fluxo na Fundação Oswaldo Cruz, do Rio de Janeiro. Em 1991, o laboratório do Hospital Albert Einstein, sob o comando da Dra Nydia Bacal e do Dr Luiz Gastão Rosenfeld, realizou o primeiro diagnóstico onco-hematológico por citometria de fluxo no Brasil.
Como princípio básico da citometria de fluxo, temos a identificação, quantificação e separação de populações celulares a depender de epítopos expressos, conhecidos como clusters de diferenciação ou CDs.
No processamento de amostras para análise, os CDs são marcados com anticorpos monoclonais e fluorocromos, ligando-se à superfície da célula ou no interior delas (Figura 1).
Figura 1 – Esquema célula-anticorpo-fluorocromo
Um citômetro utiliza três sistemas: de fluidos, ótico e eletrônico. O sistema de fluidos é responsável por alinhar as células para que sejam, uma a uma, interceptadas por lasers. O sistema ótico, composto por filtros e espelhos, detecta a emissão de luz e fluorescência e o sistema eletrônico transforma os dados obtidos para que sejam analisados graficamente.
Pode-se distinguir três principais parâmetros celulares: tamanho, complexidade interna e fluorescência (Figura 2). O parâmetro de tamanho, conhecido como forward scatter (FSC), é gerado a partir da sombra formada na interceptação da célula pelo laser, de maneira que a sombra formada é proporcional ao tamanho da célula. A complexidade interna, conhecida como side scatter (SSC), é avaliada a pela dispersão lateral de luz após interceptação da célula pelo laser. Por fim, o parâmetro de fluorescência será obtido pela expressão dos CDs na célula e as marcações, com anticorpos e fluorocromos, realizadas previamente.
Por fim, todos os dados obtidos são avaliados graficamente em softwares específicos.
Entre as principais aplicações da citometria de fluxo, iremos destacar a hematologia, imunologia e pesquisa científica.
Figura 2 – Parâmetros avaliados pela citometria de fluxo: forward scatter (FSC), side scatter (SSC) e fluorescência. Imagem editada: Flow Cytometry Animation – Star CellBio (Youtube)
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