ARTIGO I – ED 166 | A Importância da Aplicação de Novas Metodologias no Diagnóstico da Toxoplasmose em Pacientes Imunossupressos

855

The Importance of the Application of New Methodologies in the Diagnosis of Toxoplasmosis in Immunossupressed Patients

 

Stéfani Werlang Sacon¹, Allyne Cristina Grando¹

1Universidade Luterana do Brasil (ULBRA). Canoas, RS, Brasil

 

 

Resumo

A detecção da toxoplasmose com as técnicas de imunoensaios padronizadas no mercado nem sempre se mostra eficaz no diagnóstico dos imunossupressos, das gestantes e dos neonatos, uma vez que esses pacientes possuem uma capacidade reduzida de geração de anticorpos detectáveis nestes métodos. Com a falha no diagnóstico precoce e preciso da doença diversas sequelas podem ser registradas nos pacientes afetados, sequelas que acabam gerando diversos gastos para a saúde pública. Este artigo de revisão visa mostrar as técnicas promissoras no diagnóstico destes pacientes, principalmente as moleculares utilizando a reação em cadeia da polimerase, bem como apresentar as vantagens e desvantagens da implementação destas técnicas na rotina clínica.

Palavras-chave: Toxoplasmose, Toxoplasma gondii, imunossupressos, reação em cadeia da polimerase, diagnóstico.

 

Abstract

The detection of toxoplasmosis with the market standardized techniques do not always prove effectiveness in the diagnosis of immunosuppressed, pregnant and neonates, once those patients have a reduced ability for creation of antibodies that are detectable through these methods. With failure of early and precise disease diagnosis, several sequels can be registered in the affected patients, sequels that end up creating several expenses for public health. This review article intends to show the promising techniques for diagnosis of those patients, mainly the molecular, using the polymerase chain reaction, as well as showing the advantages and disadvantages of the implementation of techniques on clinical routine.

Keywords: Toxoplasmosis, Toxoplasma gondii, imunossupressed, polymerase chain reaction, diagnosis.

 

 

 

1. Introdução

O Toxoplasma gondii é um protozoário intracelular obrigatório que infecta mundialmente cerca de um terço da população humana¹. Foi descoberto por acidente em 1908 por Nicolle e Manceaux na Tunísia enquanto os pesquisadores buscavam estudar casos de Leishmania sp, neste mesmo ano o parasita foi encontrado no Brasil por Splendore². O T. gondii está diretamente ligado aos felinos, uma vez que o seu ciclo biológico se completa no intestino delgado dos mesmos³, os tornando os hospedeiros definitivos do parasita. Um gato que está infectado pode liberar milhões de oocistos em suas fezes sem apresentar qualquer sintoma da doença, estes oocistos irão sobreviver no meio ambiente por meses se as condições de temperatura e umidade forem favoráveis².

Quando os gatos ingerem animais contaminados, como por exemplo os ratos, os bradizoítos serão liberados no intestino do felino, irão infectar as células da mucosa e se diferenciarão em gametócitos masculinos e femininos; os gametas vão se fundir e formar os oocistos que serão excretados nas fezes dos gatos, contaminando o solo, a água e os alimentos; animais e humanos que consumirem estes alimentos ou esta água poderão ser infectados, completando assim, o ciclo do T. gondii⁴.

A infecção nos humanos começa quando há o consumo de carne mal-cozida contaminada com os cistos ou quando há contato direto com as fezes dos gatos contaminados⁵. No intestino há a ruptura dos cistos, que invadem a parede intestinal, são ingeridos pelos macrófagos para então se tornar taquizoítos que se multiplicam rapidamente, estes matam as células onde estão e infectam outras. Quando há a resposta do sistema imunológico, os parasitas entram nas células dos tecidos e se diferenciam em bradizoítos, que é uma forma de multiplicação lenta⁴.

O consumo de carne mal-cozida seria um dos possíveis motivos pelos quais o Rio Grande do Sul possui uma prevalência alta de toxoplasmose ocular, principalmente no Noroeste do estado. Isso poderia ser explicado pela colonização europeia expressiva e junto com ela alguns hábitos de criar porcos e consumir sua carne, nem sempre bem cozida, assim como salames e outros defumados, por exemplo. Os descendentes destes imigrantes que mantiveram estes hábitos de vida e alimentares estariam, teoricamente, mais expostos à doença⁶. No Brasil a prevalência do parasita em humanos possui uma ampla gama que vai de 64,9% a 91,6% dependendo da região estudada⁷.

Em indivíduos imunocompetentes a toxoplasmose raramente causa sintomas ou outros problemas sérios, apenas entre 10 e 20% dos casos são sintomáticos e relatam linfadenopatia cervical. Os mais afetados pelo parasita são as gestantes, os recém-nascidos de gestantes contaminadas e os imunossupressos, uma vez que seu sistema imunológico está depreciado¹. Como a gestação é apontada como uma forma de imunossupressão⁸, as complicações nestas pacientes também serão abordadas neste artigo de revisão. Em gestantes, a infecção com o parasita pode causar aborto ou trazer complicações severas ao feto como, por exemplo, coriorretinite e retardo no desenvolvimento. Em imunossupressos pode causar encefalite e infecções sistêmicas, levando à morte¹.

 

2. Gestantes e Recém-Nascidos

As gestantes que já tiveram contato com o parasita antes de engravidar e que já tenham desenvolvido imunidade não irão transmitir a infecção ao feto, a não ser que haja uma reativação da doença durante a gestação, o que é comum em pacientes com o Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), em mulheres que estejam recebendo corticóides, que possuam alguma outra doença hematológica maligna ou estejam recebendo qualquer outro tipo de imunossupressor. Os danos causados irão depender da virulência da cepa do parasita, da integridade do sistema imune da gestante e do período gestacional em que a mulher está^9,10. O fato de que os sintomas na mãe sejam brandos não significa que isso se aplica ao feto e, quanto mais cedo na gestação a mãe se contaminar com o T. gondii ou reativar a doença, mais graves serão os danos causados ao feto^1,10.

Caso a infecção ocorra no primeiro trimestre da gestação as chances de contaminação do feto são baixas (15%), pois a placenta possui dimensões pequenas tornando mais difícil o acesso do T. gondii a esse tecido, entretanto, caso a infecção se estabeleça as consequências podem ser gravíssimas uma vez que é nesse período gestacional que ocorre a organogênese, podendo ocorrer inclusive a morte fetal. No segundo trimestre com o aumento da placenta, a chance de infecção fetal também aumenta (30%), mas como a organogênese já ocorreu as consequências serão menos graves, nesse caso poderá ocorrer a Tétrade de Sabin (retinocoroidite, calcificações cerebrais, retardo mental e hidrocefalia com macro ou microcefalia). Já no terceiro trimestre a chance de infecção fetal é de 60% mas as consequências causadas não são tão graves, a criança poderá nascer normal e em alguns dias ou meses após o parto existe a possibilidade de que ela desenvolva febre, manchas pelo corpo e cegueira^8,10. O Ministério da Saúde (MS) preconiza que o tratamento seja realizado com espiramicina, alternada ou não com sulfadiazina, ácido folínico e pirimetamina dependendo da idade gestacional e infecção fetal¹¹. É importante salientar que este tratamento, mesmo com a reposição do ácido folínico, pode causar teratogênese, mostrando a importância de iniciar o tratamento apenas quando se tem certeza de que há realmente uma infecção ativa⁸. Em 2010 foi aprovada a lei estadual n° 13.592 onde, no Estado do Rio Grande do Sul, tornou-se obrigatório o exame de toxoplasmose em gestantes e recém-nascidos dos hospitais públicos e privados que dispõem do Sistema Único de Saúde (SUS)¹².

Um artigo de Quadros et al. (2015) mostra que na França, em 8 anos houve uma redução da prevalência de toxoplasmose de 10,5% com a implantação de medidas de higiene e mudança dos hábitos alimentares das gestantes¹³, isso mostra que se o SUS investir em políticas de prevenção e de conhecimento da toxoplasmose por parte da população a prevalência da doença tende a cair com o passar dos anos. Em Londrina, no Paraná, foi implantado no ano de 2006 o “Programa de Vigilância da Toxoplasmose Congênita”, que em 4 anos reduziu em 63% o número de gestantes infectadas e em 42% o número de crianças encaminhadas aos serviços de referência, aumentando a disponibilidade de vagas para que pacientes com outras doenças sejam atendidos¹⁴.

De acordo com o Manual Técnico de Gestação de Alto Risco, do Ministério da Saúde (2012), recomenda-se a triagem por meio da detecção de anticorpos da classe IgG e IgM na primeira consulta de pré-natal, caso a gestante tenha sorologia negativa para IgM e IgG no primeiro exame deverá ser realizado um acompanhamento sorológico a cada dois ou três meses¹⁵. Estudos que apontam que a gestação é uma forma de imunossupressão não descartam a reativação de infecção latente também em gestantes⁸, e ainda mostram a necessidade da utilização de outras técnicas no diagnóstico, pois a detecção de anticorpos tanto na mãe quanto no feto atingem um percentual de detecção de apenas 89,9% devido às mudanças hormonais na mãe e à imaturidade do sistema imunológico do recém-nascido¹⁶, nota-se também que a sensibilidade e especificidade da IgM não é de 100% como costuma-se pensar, ela varia de 77,5% a 99,1% e 93,3% a 100%, respectivamente⁸. Outros estudos também mostram que existem falhas na produção de IgM e IgG nas primeiras semanas da infecção, tornando difícil a correta detecção da parasitemia tanto no feto quanto na mãe¹⁷. Além disso, a detecção de IgM também só se mostra eficaz em 75% das crianças testadas¹⁸. A incerteza no diagnóstico pode condenar o feto a sequelas gravíssimas, que além de afetar a família afetariam a sociedade como um todo, pois os gastos gerados ao sistema público de saúde são indiscutivelmente elevados⁸.

Em Bernardino do Campo, no estado de São Paulo, em um estudo realizado com amostras de soro de 308 gestantes, a prevalência de anticorpos IgM foi de 5,84% e a de IgG foi de 65,59%, sendo que 28,57% das gestantes ainda corriam risco de desenvolver a doença durante a gestação e prejudicar o feto¹⁹. No Paraná a prevalência de IgG positiva foi de 51,7%. A positividade de IgM foi detectada em 29 mulheres (1,3%) sendo que 28 delas possuíam IgG de alta avidez, indicativo de infecção anterior à gestação, não oferecendo riscos ao feto. Uma das gestantes que possuía IgG de alta avidez teve os anticorpos detectados apenas após a 16ª semana de gestação, o que não exclui a possibilidade de que ela tenha se contaminado com o parasita logo no início da gravidez e que o feto possa vir a desenvolver problemas²⁰. No Noroeste do Rio Grande do Sul, foram analisadas amostras de 2.126 gestantes, sendo que 74,5% apresentaram anticorpos específicos anti-T. gondii, e 3,6% foram IgM reagentes. Em 25,1% das gestantes não foram identificados anticorpos, o que as torna suscetíveis à infecção durante a atual gestação ou em gestações futuras⁵. Estudos realizados na cidade de Santo Antônio da Patrulha, também no Rio Grande do Sul, apontam uma prevalência de toxoplasmose em gestantes de 53,3% sendo que 46,7% estavam suscetíveis à infecção, neste estudo não foram detectados anticorpos IgM²¹. Em Hong Kong, na Argélia e na França foram encontradas prevalências de toxoplasmose em gestantes de 9,8%, 49% e 83%, respectivamente⁵.

 

3. Transplantados e HIV Positivos

A infecção por T. gondii e suas complicações em pacientes com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é considerada uma das maiores causas de mortalidade e complicações sistêmicas¹⁷. Embora seja rara em pacientes que recebem transplantes de órgãos sólidos, quando se manifesta a toxoplasmose disseminada é conhecidamente mortal, quando se manifesta traz complicações severas que em sua maioria levam a óbito, principalmente quando a terapia com cotrimazol é iniciada mais tarde do que deveria²². Nestes pacientes imunossupressos a toxoplasmose pode causar graves problemas, que serão fatais se não forem reconhecidos e tratados da forma correta e rapidamente. Normalmente nestes pacientes a infecção ocorreu antes de eles se tornarem imunossupressos, ficando em estado de latência e se reativando com o comprometimento do sistema imunológico, uma vez que são as imunidades celular e humoral que irão diminuir a velocidade de multiplicação do parasita (que assume forma cística de resistência) bem como sua ação patogênica nos tecidos⁹. Com a baixa capacidade de geração de anticorpos várias complicações podem surgir¹⁷, e sem o combate ao parasita cada vez mais danos poderão ser causados pela infecção¹⁶.

Um relato de caso feito por Patrat-Delon et al. (2010) mostra que um paciente que recebeu um transplante de coração possuía sorologias indicativas de infecção passada, bem como o doador do órgão, ambos possuíam IgG positiva de alta avidez e IgM negativas. Ao realizar o transplante foi feita uma profilaxia padrão, que normalmente é utilizada contra Pneumocystis sp, antes do início da terapia de imunossupressão. Essa terapia padrão, ao ser interrompida para o início da imunossupressão, facilitou que o T. gondii se multiplicasse e causasse uma infecção disseminada no paciente. O paciente em questão seguiu com inúmeras complicações causadas tanto pelo T. gondii quanto por outros patógenos e precisou ficar internado em uma clínica de reabilitação por mais de um ano²². Normalmente os transplantes de coração e coração-pulmão associados estão mais ligados à transmissão do T. gondii a receptores de órgãos soronegativos^23,24, já os transplantes de medula óssea estão associados à reativação da doença passada, sendo estes os que possuem uma maior taxa de mortalidade²².

A reativação da doença também pode ocorrer em pacientes HIV positivos que não seguem o tratamento corretamente, e com pessoas recebendo quaisquer terapias imunossupressoras. Existem casos, embora raros, de infecção primária após o transplante, sendo estes os pacientes que não apresentavam nem IgM e nem IgG positivas antes da imunossupressão. No caso de um transplante de órgão sólido, o órgão pode estar contaminado com a forma latente do parasita em forma cística, o bradizoíto, que comumente fica em forma de latência no coração, no cérebro e no músculo esquelético^16,23, após o transplante o protozoário será carreado pelo órgão até o receptor, que por estar imunossupresso irá desenvolver sintomas graves como, por exemplo, encefalite, miocardite e infecção sistêmica, e em raros casos pneumonia²⁵. Um estudo feito por Robert-Gangneux et al. (2015) mostrou que a detecção do T. gondii em imunossupressos foi muito maior nos pacientes que não eram portadores do vírus HIV, sendo estes pacientes os que receberam algum transplante e estão em tratamento com imunossupressor²⁴. De acordo com Weiss e Dubey (2009) a incidência de toxoplasmose devido a transplantes de órgãos é atualmente desconhecida, pois não há um registro definitivo feito destes casos^1,24, mas alguns estudos retrospectivos são mostrados na Tabela 1. O número de mortes por toxoplasmose vistos neste estudo não são expressivos, mas como diversos pacientes foram perdidos para acompanhamento muitos casos podem ter ficado sem o diagnóstico final da doença e, como observado anteriormente, não existe um registro definitivo dos casos, tornando estes números pouco fidedignos²³. Como o diagnóstico definitivo da encefalite toxoplásmica nos imunossupressos se dá através de técnicas histopatológicas extremamente invasivas, a padronização de novas técnicas seria de extrema utilidade²⁶.

De acordo com um estudo realizado em 1990, o T. gondii causou pneumonia em 5% dos pacientes com AIDS em estágio avançado com uma taxa de mortalidade de 35%¹. Em Pelotas, no Rio Grande do Sul, um estudo com 250 pacientes HIV positivos detectou uma prevalência de anticorpos IgG de 80% entre os mesmos, mas não foi detectada positividade para IgM. Esta prevalência foi mais alta do que a encontrada em gestantes (54,8%) e doadores de sangue (57,5%) na cidade. A prevalência entre os imunossupressos encontrada neste estudo foi similar à encontrada no Pará (82,9%) e na Bahia (77,3%)²⁷. Estes pacientes são provavelmente aqueles que seguem o tratamento do HIV de forma correta, e mesmo que possuam a forma latente do T. gondii, o parasita ainda não achou o momento propício para causar a reinfecção. Um problema que os pacientes que já tiveram toxoplasmose e foram tratados enfrentam é que a maioria dos medicamentos utilizados no tratamento não são efetivos contra as formas císticas do parasita, assim os bradizoítos ficarão nos tecidos em forma cística aguardando o momento apropriado para se multiplicar novamente e reinfectar o paciente²⁸.

Uma rápida detecção da doença faria o tratamento ser iniciado precocemente, evitando sequelas e aumentando a sobrevida destes pacientes em até 60%²⁵, diminuindo também seu tempo de permanência no hospital e os gastos desnecessários com internação e tratamento²⁸.

 

4. Diagnóstico

O diagnóstico da toxoplasmose é feito principalmente com testes imunológicos de pesquisa de anticorpos IgM (fase aguda) e IgG (fase crônica) no soro do paciente através das técnicas de imunoensaio, como ELISA (enzyme linked immuno assay), ELFA (Enzime linked fluorescent assay) e as de quimioluminescência, como CMIA (chemioluminescent microparticle immuno assay), menos comumente também se pode pesquisar IgE e IgA⁷, a última costuma ser produzida antes da IgM e pode durar por vários meses, embora de maior custo²⁹, a detecção destes anticorpos em neonatos pode indicar infecção ativa com a produção de anticorpos próprios, uma vez que as mesmas não atravessam a placenta³. Quando apenas IgM e IgG são dosadas é difícil distinguir infecção latente de infecção recente, então se faz necessário o uso de um teste de detecção de avidez de IgG. A presença de IgG de baixa avidez juntamente com a presença de IgM sugere infecção primária. A presença de IgG de alta avidez concomitantemente com dosagens positivas de IgM sugere uma reativação da infecção latente ou da persistência de IgM no soro. Entretanto avidez baixa não significa necessariamente uma infecção recente, pois estes anticorpos de baixa avidez podem permanecer no soro do paciente por alguns meses⁷ e as IgMs residuais podem permanecer por períodos de até 12 meses¹⁷. Outras técnicas que não são muito usadas frequentemente, mas que podem ser utilizadas são as de hemaglutinação (pode levar a falso-positivos devido à reação cruzada), imunofluorescência indireta (permite a titulação das Ig’s, mas seu resultado de IgM não é muito sensível devido à competição com IgG’s, o que pode causar resultados falso-negativos), e a técnica de Sabin-Feldman (identifica o parasita no sangue apenas durante a fase aguda da doença)^7,19,29.

Além destes métodos, outro que chama atenção por seus resultados sensíveis principalmente para detecção de cistos em tecidos é o bioensaio²³, onde a amostra a ser pesquisada é inoculada em camundongos knockout que depois são analisados para a identificação do parasita em seu líquido peritoneal ou em seus tecidos através de técnicas histológicas e de soroconversão. Entretanto esta técnica consome muito tempo com os animas, é consideravelmente cara e expõe os funcionários ao risco de contaminação¹⁸. Ela costumava ser muito utilizada no início do desenvolvimento e padronização de novos métodos, como mostram os estudos de Joss et al. e de Khalifa et al., de 1993 e 1994 respectivamente, para auxiliar na comparação de resultados e avaliação da sensibilidade e especificidade das variações da técnica que estava sendo testada e possuía resultados considerados encorajadores^30,31.

 

5. Métodos Moleculares

Inicialmente, por volta da década de 90, os métodos moleculares não apresentavam sensibilidade e especificidade satisfatórias para a detecção do T. gondii, pois os laboratórios ainda não possuíam o conhecimento necessário a respeito do manejo das amostras e da técnica específica para detecção do parasita³². Após vários estudos em diferentes países essas técnicas têm despontado em vantagens, uma vez que se baseiam na amplificação enzimática in vitro de determinado segmento de DNA do parasita, possibilitando a execução do método com quantidades pequenas de amostras em um curto período de tempo, sendo assim, hoje em dia, muito específicas na pesquisa do T. gondii. Sua elevada sensibilidade jaz na sequência gênica correta a ser amplificada, na ausência de inibidores da enzima, e na amostra de escolha para análise²⁹.

Sabidamente o diagnóstico pelas formas convencionais estabelecidas pelo Center of Disease Control (CDC) se encontra prejudicado nos pacientes imunossupressos devido à baixa capacidade para gerar os anticorpos em títulos elevados o suficiente para serem detectáveis^{17, 28, 33, 34}. Os testes que estão no mercado usam antígenos direcionados especificamente aos taquizoítos, que são menos antigênicos que determinadas proteínas. Estudos têm mostrado que algumas das proteínas expressas pelo parasita poderão induzir uma resposta imune detectável também nos pacientes imunossupressos²⁸.

Proteínas recombinantes têm se mostrado muito promissoras, e acabam utilizando métodos que necessitam de biologia molecular e biotecnologia^29,35. Um estudo feito por Arab-Mazar et al. (2016) mostra que a proteína GRA7 expressa pelo parasita, possui maior antigenicidade e expressão do que os antígenos de superfície dos taquizoítos, pois foi desenvolvida por métodos de clonagem gênica, não possuindo as impurezas que os antígenos de mercado possuem, dessa forma interagindo melhor com os anticorpos anti-GRA7 do soro do hospedeiro mesmo ele sendo imunossupresso, pois seriam anticorpos produzidos em grande quantidade e de longa duração. Está se tentando padronizar uma técnica de ELISA baseada na detecção de anticorpos para esta proteína purificada e os resultados se mostram promissores²⁸.

Diversos métodos moleculares vêm sendo testados para chegar a conclusões definitivas a respeito de qual seria o mais adequado para a detecção do T. gondii seja em amostras de sangue, de lavado broncoalveolar (LBA), de líquido amniótico (LA) ou de líquido cefalorraquidiano (LCR), sendo a reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional um dos mais utilizados nos fluídos biológicos citados anteriormente²⁹. Com a grande variedade de métodos testados em diversos países, foram testados no Brasil quatro métodos de PCR que tiveram suas especificidade e sensibilidade comparadas, como é mostrado na Tabela 2.

Observando os resultados obtidos pôde-se notar que a real-time PCR se mostrou mais sensível e específica que as outras três técnicas testadas, isso pode ser explicado pela diminuição de etapas da técnica, evitando maior tempo de manipulação da amostra e assim, evitando possíveis erros relacionados a isso³⁶.

Na França foi observado que o T. gondii é melhor detectado na PCR quantitativa utilizando o gene REP-529 ao invés do até então utilizado gene B1³⁷, o primeiro se repete cerca de 200 vezes no genoma do parasita enquanto que o segundo se repete apenas 35 vezes²³, porém estudos mostraram que há variações no número de repetições de ambos os genes dependendo da cepa do parasita estudada³⁸. Assim, devido ao seu maior número de repetições, o REP-529 tornaria possível detectar precocemente uma baixa carga parasitária nas amostras do paciente. Entretanto, na América do Sul os resultados não foram reprodutíveis, acredita-se que as cepas de T. gondii que possuímos aqui sejam diferentes e mais patogênicas do que as européias, sendo assim o gene B1 foi mais sensível e específico para os casos daqui do que o gene REP-529³⁹, entretanto o gene B1 também apresenta a desvantagem de amplificar determinadas regiões dos cromossomos humanos, tornando necessária uma avaliação cuidadosa dos resultados¹⁷. O gene B1 acabou gerando duas vezes mais resultados falso-negativos do que o gene REP-529 em um estudo realizado por Hierl et al. na Alemanha em 2004³⁴. A grande diversidade de cepas já isoladas do parasita (cerca de 1500) acaba fazendo com que nem todas as técnicas de PCR padronizadas e testadas na Europa funcionem aqui e vice versa, por esse motivo ressalta-se a importância dos trabalhos feitos no Brasil²⁹, nota-se também que as altas sensibilidades encontradas nas técnicas de PCR executadas aqui no Brasil e em Cuba (de 69 a 83%) podem estar relacionadas à alta virulência do parasita²³.

Devido à alta prevalência de toxoplasmose na França, acabou sendo criado um guia de controle de qualidade para que as diversas técnicas moleculares utilizadas nos laboratórios sigam determinadas normas para evitar resultados falso-positivos e falso-negativos⁴⁰. A grande dificuldade de padronização das técnicas está no fato de que a grande maioria delas é desenvolvida in house e cada laboratório adota uma metodologia diferente⁴¹. Na Líbia, Gashout et al. (2016) conseguiram padronizar uma técnica de semi-nested-PCR que foi capaz de detectar concentrações mínimas do T. gondii nos fluídos corporais analisados, mostrando especificidade e sensibilidade elevadíssimas, fazendo com que a realização de PCR na rotina clínica se torne algo cada vez mais próximo⁴².

Em um caso de reativação da toxoplasmose em um paciente que recebeu transplante de células tronco, a PCR em tempo real (rt-PCR) e a PCR associada ao ELISA mostraram-se eficazes para detecção precoce da doença e para a avaliação da eficácia do tratamento, os sintomas clínicos, neste caso, apareceram uma semana depois da positividade da PCR, mostrando que estas técnicas podem ser utilizadas no diagnóstico precoce antes que haja complicações, no acompanhamento da evolução de casos de pacientes que estejam em alto risco de desenvolver toxoplasmose e na monitorização terapêutica, principalmente quando o paciente precisa ter um tratamento com baixas doses dos medicamentos ou precisa postergar o início das medicações por complicações sistêmicas⁴³. Isso seria de extrema valia nos pacientes que recebem transplante de órgãos sólidos, pois não são todos os medicamentos contra o T. gondii que eles podem receber devido à toxicidade que poderia levar à rejeição do órgão transplantado, ou até mesmo a complicações hepáticas, sendo essa uma situação extremamente delicada²².

 

6. Considerações Finais

Por enquanto parece ser relativamente inviável tornar o diagnóstico molecular o padrão ouro para detecção de toxoplasmose devido ao alto custo inicial para a implantação na saúde pública, algo que se sabe não ser possível. Em 2002, Bastien já defendia a ideia de que o desenvolvimento de novas técnicas deveria visar a utilização na rotina hospitalar⁴⁴. Numerosos testes têm sido desenvolvidos desde então, e muitos outros já se encontram disponíveis no mercado, mas nenhum deles foi validado com uma quantia considerável de amostras clínicas⁴⁵, pois ainda não foi estabelecido um consenso definitivo a respeito da melhor técnica¹⁷. O interessante é que conforme a demanda aumente ao longo dos anos, o custo destes métodos diminuirá, tornando assim possível a detecção precoce do T. gondii nos pacientes imunossupressos e em pessoas com perfil sorológico de difícil interpretação, principalmente nas gestantes que possuem IgM positiva com IgG de alta avidez, pois as técnicas permitiriam diferenciar entre IgMs persistentes e reinfecção recente⁴⁶. A rt-PCR, embora permaneça cara, se mostrou útil para quantificar a carga parasitária¹⁸, mas parece se adequar melhor para monitorar a eficácia do tratamento⁴³ e também auxiliar na detecção da parasitemia nas gestantes, evitando uma intervenção terapêutica desnecessária⁴⁶, a PCR quantitativa também se mostra útil nestes casos, uma vez que pode detectar a parasitemia de forma bastante precoce e ajudar na tomada de decisões e manejo terapêutico⁴⁷.

É de extrema importância que cuidados sejam tomados tanto para a padronização da técnica quanto na análise das amostras posteriormente, não podendo existir inibidores da técnica, pois assim muitos resultados falso-negativos seriam encontrados²⁶. É importante lembrar que as amostras de sangue nem sempre são a melhor escolha diagnóstica, pois em sua maioria elas irão detectar apenas se houver uma passagem do parasita pelo sangue, não sendo capazes de detectar, por exemplo, pneumonia e encefalite causadas pelo T. gondii, sendo que nestes casos pode-se utilizar como amostra biológica o LBA e o LCR, respectivamente¹⁷. O diagnóstico de toxoplasmose ocular também pode ser feito utilizando amostras de humor aquoso, uma vez que o sangue total não fornece a sensibilidade necessária nestes casos⁴⁸,  podendo se observar que a PCR não tem relação com a presença de lesões oculares e o grau de parasitemia, tendo uma positividade baixa nas crianças com menos de dois meses de vida³⁸. Ao implementar estas medidas se evitariam procedimentos invasivos em pacientes que, na maioria das vezes, encontram-se em uma situação de saúde muito delicada, principalmente os que têm suspeita de encefalite e de toxoplasmose disseminada.

Com o surgimento do HIV e o aumento do número de pacientes portadores do vírus, bem como o aumento de pacientes transplantados e imunossupressos por diversas outras doenças, ainda existe um número grande de pessoas em risco de desenvolver complicações causadas pela toxoplasmose, e novas técnicas moleculares se fazem muito necessárias no diagnóstico destes pacientes imunossupressos, neonatos e gestantes, já que uma detecção precoce e uma resolução de casos sorológicos complicados diminuem e muito a morbimortalidade que o T. gondii pode causar¹⁷.

Estudos mostram que a prevalência de encefalite toxoplásmica pode chegar a 40% em HIV positivos, sendo que destes pacientes, entre 10 e 30% morrerão por complicações da doença que não é diagnosticada precocemente²⁸, mesmo com o advento da terapia antirretroviral altamente ativa (HAART) e a diminuição dos casos de encefalite toxoplásmica, o número de casos tem se mantido estável ao longo dos anos²⁴, novos métodos não devem ser deixados de lado, visto que ainda assim diversos pacientes optam por não seguir o tratamento devido aos efeitos colaterais causados por ele^33,49. O mesmo acontece em casos de gestantes que têm um perfil sorológico de difícil interpretação ou que possuem resultados sorológicos indeterminados ou duvidosos, um diagnóstico mais fidedigno poderia vir a reduzir as complicações causadas ao feto caso sofresse contaminação vertical.

O uso da PCR concomitantemente com técnicas radiológicas e o diagnóstico clínico seria de extrema importância e utilidade³³. Os custos seriam altos, mas seriam facilmente recuperados ao diminuir o tempo de hospitalização e os gastos prolongados com medicamentos. Nos Estados Unidos, os gastos anuais com o tratamento e hospitalização de pacientes com toxoplasmose chegam a 7,7 bilhões de dólares, sendo que esta quantia é tão grande principalmente devido às complicações causadas ao feto pela transmissão via placenta⁸. Embora demorado, com certeza haveria um retorno financeiro ao evitar tratamentos e internação prolongados dos pacientes em maior risco^26. Entretanto, para a utilização faz-se necessário que os métodos diagnósticos de ponta sejam aprovados e liberados para o uso pelo SUS e mão-de-obra qualificada seja contratada para a realização das técnicas.

 

7. Conflito de Interesses

Os autores declaram que não existem conflitos de interesses.

 

8. Referências Bibliográficas

 

1. Weiss LM, Dubey JP. Toxoplasmosis: a history of clinical observations. Int J Parasitol. 2009;39(8):895-901.
2. Dubey JP, Lago EG, Gennari SM, Jones JL. Toxoplasmosis in humans and animals in Brazil: high prevalence, high burden of disease and epidemiology. 2012;139:1375-424.
3. da Costa TL, da Silva MG, Rodrigues IMX, Barbaresco AA, Avelino MM, de Castro AM. Diagnóstico clínico e laboratorial da toxoplasmose. News Lab. 2007;85:88-104.
4. Levinson W. Review of medical microbiology and immunology. 10ª ed. Nova Iorque. Lange; 2008. Capítulo 52, Blood and tissue protozoa;360-70.
5. Spalding SM, Amendoeira MRR, Klein CH, Ribeiro LC. Serological screening and toxoplasmosis exposure factors among pregnant women in South of Brazil. Rev Soc Bras Med Trop. 2004;38(2):173-7.
6. Barbosa IR. Estudo epidemiológico da toxoplasmose em gestantes atendidas na maternidade escola Januário Cicco, Natal, Rio Grande do Norte [dissertação mestrado]. Natal: Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Biociências, Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia;2008.
7. Pena LT, Discacciati MG. Importância do teste de avidez da imunoglobulina G (IgG) anti-Toxoplasma gondi no diagnóstico da toxoplasmose em gestantes. Rev Inst Adolfo Lutz. 2013;72(2):117-23.
8. Bortoletti Filho J, Araújo Júnior E, Carvalho NS, Helfer TM, Serni PON, Nardozza LMM, et al. The importance of IgG avidity and the polymerase chain reaction in treating toxoplasmosis during pregnancy: current knowledge. Interdiscip Perspect Infect Dis. 2013;26:1-5.
9. Vaz AJ. Diagnóstico imunológico das parasitoses. In: de Carli, GA. Parasitologia clínica: seleção de métodos e técnicas de laboratório para o diagnóstico das parasitoses humanas. 1ª ed. São Paulo: Atheneu; 2001.505-39.
10. de Carvalho AGMA, Lima JS, de Lima MSPR, Mota CAX. Diagnóstico laboratorial da toxoplasmose congênita. Rev Cienc Saúde Nova Esperança. 2014;12(1):88-95.
11. Margonato FB, Silva AMR, Soares DA, Amaral DA, Petris AJ. Toxoplasmose na gestação: diagnóstico, tratamento e importância de protocolo clínico. Rev Bras Saúde Matern Infant. 2007;7(4):381-6.
12. Rio Grande do Sul (Estado). Lei n. 13.592, de 30 de Dezembro de 2010. Dispõe da obrigatoriedade do exame de toxoplasmose no Sistema Único de Saúde -SUS- no Estado do Rio Grande do Sul e dá outras providências. Diário Oficial do Estado do Rio Grande do Sul. 2010 Dez 31;n° 248.
13. de Quadros RM, da Rocha GC, Romagna G, de Oliveira JP, Riberio DM, Marques SMT. Toxoplasma gondii seropositivity and risk factors in pregnant women followed up by the Family Health Strategy. Rev Soc Bras Med Trop. 2015;48(3):338-42.
14. Lopes-Mori FMR, Mitsuka-Breganó R, Capobiango JD, Inoue IT, Reiche EMV, Morimoto HK, et al. Programas de controle da toxoplasmose congênita. Rev Assoc Med Bras. 2011;57(5):594-9.
15. Ministério da Saúde. Gestação de alto risco: manual técnico. Brasília, DF. 2012;5:115-8.
16. Amendoeira MRR, Camillo-Coura LF. Uma breve revisão sobre toxoplasmose na gestação. Sci Med. 2010;20(1):113-9.
17. Kompalic-Cristo A, Britto C, Fernandes O. Diagnóstico molecular da toxoplasmose: revisão. J Bras Patol Med Lab. 2005;41(4):229-35.
18. Abdul-Ghani R. Polymerase chain reaction in the diagnosis of congenital toxoplasmosis: more than two decades of development and evaluation. Parasitol Res. 2011;108:505-12.
19. Ferreira M, Bicheri MCM, Nunes MB, Ferreira CCM. Diagnóstico laboratorial da infecção por Toxoplasma gondii na gestação. Rev Bras Anal Clin. 2007;39(1):37-8.
20. Lopes-Mori FMR, Mitsuka-Breganó R, Bittencourt LHFB, Dias RCF, Gonçalves DD, Capobiango JD, et al. Gestational toxoplasmosis in Paraná State, Brazil: prevalence of IgG antibodies and associated risk factors. Braz J Infect Dis. 2013;17(4):405-9.
21. da Rocha LC, Kober MV, Grivicich I. Sorologia para toxoplasmose em gestantes e recém-nascidos em Santo Antônio da Patrulha, Rio Grande do Sul. Clin Biomed Res. 2014: 34(4):366-70.
22. Patrat-Delon S, Gangneux JP, Lavoué S, Lelong B, Guiguen C, le Tulzo Y, et al. Correlation of parasite load determined by quantitative PCR to clinical outcome in a heart transplant patient with disseminated toxoplasmosis. J Clin Microbiol. 2010;48(7):2541-5.
23. Gangneux-Robert F, Dardé ML. Epidemiology of and diagnostic strategies for toxoplasmosis. Clin Microbiol Rev. 2012;25(2):264-96.
24. Gangneux-Robert F, Sterkers Y, Yera H, Accoceberry I, Menotti J, Cassaing S, et al. Molecular diagnosis of toxoplasmosis in immunocompromised patients: a 3-year multicenter retrospective study. J Clin Microbiol. 2015;53(5):1677-84.
25. Dora JM, Geib G, de-Paris F, Machado MP, Furlanetto TW, Souza CSM, et al. Diagnosis of disseminated toxoplasmosis by polymerase chain reaction in bronchoalveolar lavage fluid of a patient with AIDS. Clin Biomed Res. 2009;29(2):167-9.
26. Colombo FA, Vidal JE, de Oliveira ACP, Hernandez AV, Bonasser-Filho F, Nogueira RS, et al. Diagnosis of cerebral toxoplasmosis in AIDS patients in Brazil: importance of molecular and immunological methods using peripheral blood samples. J Clin Microbiol. 2005;43(10):5044-7.
27. Xavier GA, Cadermatori BG, Cunha Filho NA, Farias NAR. Evaluation of seroepidemiological toxoplasmosis in HIV/AIDS patients in the South of Brazil. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2013;55(1):25-30.
28. Arab-Mazar Z, Fallahi S, Koochaki A, Haghighi A, Tabaei SJS. Immunodiagnosis and molecular validation of Toxoplasma gondii-recombinant dense granular (GRA) 7 protein for the detection of toxoplasmosis in patients with cancer. Microbiol Res. 2016;183:53-9.
29. Liu Q, Wang ZD, Huang SY, Zhu XQ. Diagnosis of toxoplasmosis and typing of Toxoplasma gondii. Parasites Vectors. 2015;8:292-306.
30. Joss AWL, Jean M, Chatterton W, Evans R, Ho-Yen DO. Toxoplasma polymerase chain reaction on experimental blood samples. J Med Microbiol. 1993;38:38-43.
31. Khalifa KES, Roth A, Roth B, Arasteh KN, Janitschke K. Value of PCR for evaluating occurrence of parasitemia in immunocompromised patients with cerebral and extracerebral toxoplasmosis. J Clin Microbiol. 1994;32(11):2813-9.
32. Villard O, Filisetti D, Roch-Deries F, Garweg J, Flament J, Candolfi E. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay, immunoblotting, and PCR for diagnosis of toxoplasmic chorioretinitis. J Clin Microbiol. 2003;41(8):3537-41.
33. Alfonso Y, Fraga J, Fonseca C, Jiménez N, Pinillos T, Dorta-Contreras AJ, et al. Molecular diagnosis of Toxoplasma gondii infection in cerebrospinal fluid from AIDS patients. Cerebrospinal Fluid 2009;6:2.
34. Hierl T, Reischl U, Lang P, Hebart H, Stark M, Kyme P, et al. Preliminary evaluation of one conventional nested and two real-time PCR assays for the detection of Toxoplasma gondii in immunocompromised patients. J Med Microbiol. 2004;53:629-32.
35. Kotreshka D, Noordin R. Recombinant proteins in the diagnosis of toxoplasmosis. ACTA Pathol Microbiol Immunol Scandinavica. 2010;118(8):529-42.
36. Teixeira LE, Kanunfre KA, Shimokawa PT, Targa LS, Rodrigues JC, Domingues W. The performance of four molecular methods for the laboratory diagnosis of congenital toxoplasmosis in amniotic fluid samples. Rev Soc Bras Med Trop. 2013;46(5):584-8.
37. Sterkers Y, Varlet-Marie E, Cassaing S, Brenier-Pinchart MP, Brun S, Dalle F, et al. Multicentric comparative analytical performance study for molecular detection of low amounts of Toxoplasma gondii from simulated specimens. J Clin Microbiol. 2010;48(9):3216-22.
38. Costa JGL, Carneiro ACAV, Tavares AT, Andrade GMQ, Vasconcelos-Santos DV, Januário JN, et al. Real-time PCR as a prognostic tool for human congenital toxoplasmosis. J Clin Microbiol. 2013;51(8):2766-8.
39. Belaz S, Gangneux JP, Dupretz P, Guiguen C, Robert-Gangneaux F. A 10-year retrospective comparison of two target sequences, REP-529 and B1, for Toxoplasma gondii detection by quantitative PCR. J Clin Microbiol. 2015;53(4):1294-300.
40. Varlet-Marie E, Sterkers Y, Bastien P. Quality control for the molecular diagnosis of toxoplasmosis. In: Ivanov O, editor. Applications and Experiences of Quality Control. 1^st Rijeka: InTech; 2011; p. 217-32.
41. Filisetti D, Sterkers Y, Brenier-Pinchart MP, Cassaing S, Dalle F, Delhaes L. Multicentric comparative assessment of the bio-evolution Toxoplasma gondii detection kit with eight laboratory-developed PCR assays for molecular diagnosis of congenital toxoplasmosis. J Clin Microbiol. 2014;53(1):29-34.
42. Gashout A, Amro A, Erhuma M, Al-Dwibe H, Elmaihub E, Babba H, et al. Molecular diagnosis of Toxoplasma gondii infection in Libya. BMC Infect Dis. 2016;16:157-64.
43. Menotti J, Vilela G, Romand E, Garin YJF, Ades L, Gluckman E, et al. Comparison of PCR–enzyme-linked immunosorbent assay and Real-time PCR assay for diagnosis of an unusual case of cerebral toxoplasmosis in a stem cell transplant recipient. J Clin Microbiol. 2003;41(11):5313-6.
44. Bastien P. Molecular diagnosis of toxoplasmosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 2002;96:205-15.
45. Mikita K, Maeda T, Ono T, Miyahira Y, Asai T, Kawana A. The utility of cerebrospinal fluid for the molecular diagnosis of toxoplasmic encephalitis. Diag Microbiol Infect Dis. 2013;75:155-9.
46. Hashoosh DA, Majeed IA. Comparison of two assays in the diagnosis of toxoplasmosis: immunological and molecular. East Mediterr Health J. 2014;20(1):46-50.
47. Martino R, Bretagne S, Einsele H, Maertens J, Ullmann AJ, Parody R, et al. Early detection of Toxoplasma infection by molecular monitoring of Toxoplasma gondii in peripheral blood samples after allogeneic stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 2005;40:67-78.
48. Bourdin C, Busse A, Kouamou E, Touafek F, Bodaghi B, Le Hoang P, et al. PCR-based detection of Toxoplasma gondii DNA in blood and ocular samples for diagnosis of ocular toxoplasmosis. J Clin Microbiol. 2014;52(11):3987-91.
49. Nissapatorn V. Toxoplasmosis in HIV/AIDS patients – a living legacy. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2009;40(6):1158-78.

 

 

 

* Em todos os países acima citados houveram pacientes perdidos para acompanhamento, tornando estes números apenas estimados; ^α Reino Unido; ^β Estados Unidos;

Tabela adaptada de Robert-Gangneux e Dardé (2012)²³

 

Se: Sensibilidade; Esp: Especificidade; VPP: valor preditivo positivo; VPN: valor preditivo negativo.

* Entende-se por Valor Preditivo Positivo a chance do paciente ter a doença caso o resultado do teste seja positivo; **Entende-se por Valor Preditivo Negativo a chance do paciente não ter a doença caso o resultado do teste seja negativo

Tabela adaptada de Teixeira et al. (2013)³⁶