A cromatografia por exclusão de tamanho, também conhecida como SEC (Size-Exclusion Chromatography) ou GPC (Gel Permeation Chromatography), é uma técnica poderosa utilizada para a separação de moléculas com base em seu tamanho hidrodinâmico ou peso molecular. Diferente das formas mais comuns de HPLC que dependem de interações químicas (como polaridade ou hidrofobicidade), a SEC se baseia exclusivamente em exclusão física, sendo amplamente utilizada na análise de proteínas, polímeros, peptídeos, polissacarídeos e agregados.
Este artigo explora os fundamentos da SEC/GPC, seus mecanismos de separação, componentes do sistema, vantagens e limitações, além das aplicações mais relevantes em bioanálises, indústria farmacêutica e materiais poliméricos.
1. Fundamentos da SEC/GPC
Na SEC, os analitos são separados de acordo com seu volume de exclusão, ou seja, sua capacidade de penetrar nos poros da fase estacionária.
- Moléculas maiores não entram nos poros e eluem mais rapidamente.
- Moléculas menores penetram nos poros e, portanto, têm tempo de retenção maior.
Não há interação química significativa com a fase estacionária – a separação ocorre exclusivamente por tamanho efetivo em solução (volume hidrodinâmico).
O termo GPC é mais comum em aplicações com solventes orgânicos e polímeros sintéticos, enquanto SEC é usado para biomoléculas e sistemas aquosos.
2. Mecanismo de Separação por Exclusão
A coluna cromatográfica é preenchida com partículas porosas de gel (sílica ou polímero reticulado). A separação segue este princípio:
- A fase móvel carrega a amostra através da coluna.
- Analitos grandes passam entre os poros e saem primeiro.
- Analitos pequenos penetram mais profundamente nos poros e demoram mais para eluir.
A separação depende de:
- Diâmetro efetivo dos poros do gel
- Forma da molécula (não apenas peso molecular)
- Condições do solvente (pH, força iônica, viscosidade)
3. Componentes do Sistema Cromatográfico
3.1. Colunas
- Colunas de SEC aquosa: para proteínas, peptídeos, polissacarídeos
- Colunas de GPC orgânica: para polímeros sintéticos, materiais plásticos
- Poros calibrados para diferentes faixas de peso molecular (ex: 100–10⁶ Da)
3.2. Fase Móvel
- SEC: tampões neutros ou fisiológicos (PBS, Tris-HCl)
- GPC: solventes orgânicos como THF, tolueno, clorofórmio, DMF
- A fase móvel deve manter a molécula solubilizada e em conformação nativa
3.3. Detectores
- RI (Índice de refração): comum em GPC de polímeros
- UV/Vis: para biomoléculas com cromóforos (proteínas, ácidos nucleicos)
- LS (Light Scattering): para determinação absoluta de massa molar
- MS: menos comum, mas possível com SEC acoplada a ESI-MS
4. Aplicações da SEC/GPC
4.1. Proteínas e Biomoléculas
- Determinação de massa aparente (monômeros, dímeros, agregados)
- Análise de pureza, estabilidade e perfil de agregação
- Estudos de degradação por estresse ou armazenamento
4.2. Polímeros Sintéticos
- Determinação de distribuição de peso molecular (Mw, Mn, PDI)
- Controle de qualidade de matérias-primas
- Estudo de degradação térmica ou oxidativa
4.3. Produtos Farmacêuticos
- Análise de vacinas, anticorpos monoclonais (mAbs), conjugados
- Estudos de formulação e estabilidade de biológicos
- Comparabilidade entre lotes (biossimilares)
4.4. Polissacarídeos, Gomas e Produtos Naturais
- Determinação de tamanho e pureza de polissacarídeos e mucilagens
- Controle de qualidade em alimentos, cosméticos e farmacêuticos naturais
5. Vantagens da Cromatografia por Exclusão de Tamanho
- Técnica não destrutiva
- Separação rápida e reprodutível baseada apenas em tamanho
- Pode ser usada para estimativa de peso molecular e homogeneidade
- Compatível com biomoléculas frágeis e polímeros sintéticos complexos
- Facilmente acoplável a detectores múltiplos (UV, RI, LS, viscosidade)
6. Limitações e Cuidados
- Baixa capacidade de resolução fina, moléculas de tamanho muito próximo podem não ser separadas
- Não aplicável para moléculas interativas com a matriz (ex: adsorção indesejada)
- Interpretação depende de calibração adequada (curvas padrão ou detecção absoluta)
- Exige controle rigoroso da temperatura e viscosidade da fase móvel
- O tamanho hidrodinâmico nem sempre reflete o peso molecular exato
7. Quando Utilizar a SEC/GPC?
Conclusão
A cromatografia por exclusão de tamanho (SEC/GPC) é uma ferramenta indispensável para caracterização de macromoléculas, com ampla aplicação em bioanálises, farmacêutica, polímeros e ciência dos materiais. Sua natureza suave, seletiva e robusta permite determinar com precisão o tamanho e o comportamento conformacional de moléculas grandes em solução. Quando utilizada corretamente, com colunas adequadas e calibração apropriada, a SEC/GPC proporciona dados críticos para o desenvolvimento, controle e garantia de qualidade de moléculas complexas.
Referências Bibliográficas
- Barth, H. G., & Boyes, B. E. (1990). Modern Size-Exclusion Liquid Chromatography. Wiley.
- Hong, P., Koza, S., & Bouvier, E. S. (2012). Size-exclusion chromatography for the analysis of protein biotherapeutics and their aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies.
- ASTM D5296-19. Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography.
- USP General Chapter <129> SEC for Protein Analysis
- ICH Q6B. Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products.
AUTOR:
Edwin Bueno é engenheiro químico e especialista em cromatografia, com mais de 13 anos de experiência no desenvolvimento de métodos analíticos. Atualmente é diretor técnico da Atuallabs e consultor técnico de grandes indústrias, dedica-se a otimizar processos, garantir a qualidade analítica e disseminar boas práticas laboratoriais, contribuindo para a excelência do setor.
