Publicado no Medrxiv
Resumo
Doença do Coronavírus 2019 (COVID-19), causada pela Síndrome Respiratória Aguda Grave O Coronavírus-2 (SARS-CoV-2), está associada a uma ampla gama de manifestações clínicas, incluindo características autoimunes e produção de autoanticorpos. Desenvolvemos três matrizes de proteínas diferentes para medir os autoanticorpos IgG marcantes associados a Doenças do Tecido Conjuntivo (CTDs), Anticorpos Anticitocinas (ACA) e respostas de anticorpos antivirais em 147 pacientes COVID-19 hospitalizados em três centros diferentes. Os autoanticorpos foram identificados em aproximadamente 50% dos pacientes, mas em <15% dos controles saudáveis. Quando presentes, os autoanticorpos visam amplamente os autoantígenos associados a doenças raras, como miosite, esclerose sistêmica e síndromes de sobreposição de DTC. Anticorpos antinucleares (ANA) foram observados em cerca de 25% dos pacientes. Os pacientes com autoanticorpos tendem a demonstrar uma ou algumas especificidades, enquanto os ACA são ainda mais prevalentes, e os pacientes costumam apresentar anticorpos para várias citocinas. Pacientes raros foram identificados com anticorpos IgG contra a enzima conversora de angiotensina-2 (ACE-2). Um subconjunto de autoanticorpos e ACA desenvolvidode novo após infecção por SARS-CoV-2, enquanto outras foram transitórias. Autoanticorpos rastreados com desenvolvimento longitudinal de anticorpos IgG que reconheceram proteínas estruturais SARS-CoV-2, como S1, S2, M, N e um subconjunto de proteínas não estruturais, mas não proteínas da gripe, coronavírus sazonais ou outros vírus patogênicos. Pacientes COVID-19 com um ou mais autoanticorpos tendiam a ter níveis mais elevados de anticorpos contra a proteína 1 não estrutural SARS-CoV-2 (NSP1) e a metiltransferase (ME). Concluímos que o SARS-CoV-2 causa o desenvolvimento de novos autoanticorpos IgG em uma proporção significativa de pacientes COVID-19 hospitalizados e estão positivamente correlacionados com as respostas imunes às proteínas SARS-CoV-2.
Introdução
Doença por Coronavírus 2019 (COVID-19), causada por Síndrome Respiratória Aguda Grave A infecção por Coronavírus-2 (SARS-CoV-2), está associada a muitas características clínicas diferentes que são comumente encontradas em doenças autoimunes, incluindo artralgias, mialgias, fadiga, sicca e erupções cutâneas 1 – 3 . Manifestações menos comuns de autoimunidade também foram observadas em pacientes com COVID-19, incluindo trombose, miosite, miocardite, artrite, encefalite e vasculite 3. Essas observações clínicas e a proporção crescente de pacientes “recuperados” com sintomas persistentes pós-COVID-19 (os chamados “long haulers” ou “COVID longo”) sugerem que a inflamação em resposta à infecção por SARS-CoV-2 promove tecidos dano na fase aguda e potencialmente algumas das sequelas de longo prazo 4 – 6 .
Autoanticorpos, uma marca registrada da maioria, mas não de todas as doenças autoimunes, foram descritos em pacientes com COVID-19. No primeiro relatório, aproximadamente metade dos pacientes hospitalizados em um hospital acadêmico na Grécia apresentava níveis elevados de autoanticorpos séricos, frequentemente associados a achados clínicos como erupções cutâneas, trombose e vasculite 7 . Anticorpos antinucleares (ANA) séricos foram detectados em aproximadamente um terço dos pacientes 7 . Woodruff et al. relataram que 23 de 48 (44%) dos pacientes graves com COVID-19 apresentam testes ANA positivos 8 , 9. Zuo descreveu uma prevalência ainda maior de autoanticorpos trombogênicos, relatando que até 52% dos pacientes com COVID-19 hospitalizados apresentam anticorpos antifosfolipídios. Eles mostraram ainda que os autoanticorpos têm a capacidade de causar coágulos em modelos de camundongos 10 . Em uma grande tela de autoanticorpos, Gruber et al. demonstraram que pacientes com Síndrome Inflamatória Multissistêmica em Crianças (MIS-C) desenvolvem autoanticorpos, incluindo autoanticorpos contra o antígeno lúpico SSB / La 11 . Autoanticorpos SSB / Ro também foram descritos 12. A ligação aparente entre as manifestações clínicas semelhantes às observadas em pacientes com doenças autoimunes classificáveis e aquelas observadas em pacientes com COVID-19 levou a pesquisas por candidatos a autoantígenos alvo que podem ser úteis para o diagnóstico e para melhorar a compreensão da patogênese de COVID-19. Os alvos moleculares dos autoanticorpos em pacientes individuais com COVID-19 são amplamente desconhecidos, assim como suas associações com as respostas imunes antivirais e o momento de seu aparecimento em relação à infecção com SARS-CoV-2.
Nossa hipótese é que o SARS-CoV-2 induz a produção de anticorpos contra autoantígenos e citocinas / quimiocinas de novo, e estes se correlacionam com as respostas antivirais. Montamos três matrizes de proteínas baseadas em esferas personalizadas diferentes para medir os anticorpos IgG encontrados em CTDs, ACA e respostas antivirais em 197 amostras COVID-19. As amostras foram obtidas de 147 pacientes hospitalizados infectados pelo SARS-CoV-2, alguns dos quais foram coletados longitudinalmente, em três locais geograficamente distintos. Nossos resultados demonstram que um grande quadro de autoantígenos são direcionados por anticorpos circulantes em uma proporção substancial de pacientes hospitalizados com COVID-19, mas menos comumente em controles saudáveis não infectados (HC). Nossos estudos confirmam relatórios emergentes de autoanticorpos IgG em pacientes COVID-19 hospitalizados e demonstram que um subgrupo significativo de pacientes desenvolve novos autoanticorpos que podem colocá-los em risco de progressão para sintomáticos,
Resultados
Os anticorpos antinucleares (ANA) são produzidos por um em cada quatro pacientes COVID-19 hospitalizados
Para determinar se os pacientes hospitalizados com COVID-19 produzem autoanticorpos contra autoantígenos prototípicos associados à autoimunidade sistêmica, medimos o ANA usando um ensaio de imunofluorescência indireta em uma de nossas coortes (Universidade da Pensilvânia). Descobrimos que sete de 73 pacientes (10%) foram positivos em uma diluição de 1: 160 usando um ensaio de grau clínico e que outros 13 foram fracamente positivos ( Fig. 1a complementar ). Uma variedade de padrões de ANA foram observados, incluindo difuso, pontilhado e nucleolar ( Fig. 1b e 1c suplementares) Um paciente apresentou coloração citoplasmática, mas foi negativo para coloração nuclear. Dada a descoberta de ANAs positivos e fracamente positivos, medimos os anticorpos dsDNA. Apenas um indivíduo em 73 testados foi positivo para anticorpos dsDNA a uma diluição de 1: 270, e este indivíduo também era ANA positivo com um padrão pontilhado ( Fig. 2 suplementar ). Uma vez que vários pacientes graves ou criticamente enfermos tiveram eventos tromboembólicos e vasculares, também analisamos os mesmos 73 pacientes para anticorpos Mieloperoxidase (MPO) e Proteinase 3 (PR3), uma vez que esses anticorpos estão associados a vasculite autoimune. Apenas um indivíduo testou positivo para anticorpos PR3 ( Fig. 2 complementar) Os níveis de positividade nesses ensaios de grau clínico estão de acordo com os de um dos autores (JJ) que relatou que 17 de 113 (15,8%) pacientes com sorologia positiva para SARS-CoV-2 tinham autoanticorpos séricos e / ou anticorpos antifosfolipídeos 13 . Essas descobertas nos levaram a “lançar uma rede mais ampla” para os autoanticorpos usando pacientes adicionais e testes que detectaram um número maior de autoantígenos não apenas comuns, mas também incomuns.
Microarrays de proteínas identificam alvos de autoanticorpos em pacientes com COVID-19 hospitalizados
Para medir sistematicamente e simultaneamente um grande número de diferentes autoanticorpos no soro ou plasma derivados de pacientes agudamente infectados com SARS-CoV-2, construímos um arranjo de autoantígenos 53-plex COVID-19 ( Fig. 1 , metade esquerda do painel ). A matriz compreendia autoantígenos bem caracterizados ( Tabela 1 suplementar ) em várias doenças reumatológicas ( Fig. 3 suplementar). Incluídos estavam os antígenos proeminentes direcionados à esclerose sistêmica (esclerodermia, ES, painel esquerdo; miosite e síndromes de sobreposição, segundo painel); lúpus eritematoso sistêmico (LES), síndrome de Sjögren e doença mista do tecido conjuntivo (MCTD, terceiro painel); distúrbios autoimunes gastrointestinais e endócrinos (quarto painel); antígenos associados à cromatina (quinto painel); e antígenos diversos, incluindo proteínas direcionadas à vasculite ou nas quais os autoanticorpos são postulados como diretamente patogênicos (sexto painel). A maioria dos antígenos foram validados em publicações anteriores e também foram validados usando soro protótipo de doença autoimune comercialmente disponível ( Fig. 1 , painel inferior), ou usando soro previamente caracterizado do biobanco de Stanford e do Oklahoma Immune Cohort no Biorrepositório de Artrite e Imunologia Clínica da Oklahoma Medical Research Foundation (SLE, SSc, MCTD, cirrose biliar primária e outros distúrbios, dados não mostrados).
Nós caracterizamos 51 amostras transversais de soro ou plasma COVID-19 de pacientes que forneceram amostras dentro de sete dias de hospitalização ( Fig. 1 ). Como esperado, as amostras de referência de protótipo de pacientes com doenças autoimunes classificáveis foram fortemente positivas para autoanticorpos, reconhecendo 25 das 53 proteínas organizadas ( Fig. 1 , painel esquerdo inferior e Fig. 3 suplementar ). O soro de apenas quatro HC reconheceu um único autoantígeno cada (partícula de reconhecimento de sinal 54, SRP 54; Smith / proteína ribonuclear, Sm / RNP; subunidade alfa da proteína de ligação ao nucleotídeo guanosina, GNAL, um candidato a autoantígeno em hipofisite autoimune; e Ku 70/80, respectivamente, Fig. 1 , painel do meio) HC06 e HC30, cada um, tinham alto MFI anti-tireoperoxidase (TPO) que excedeu o ponto de corte de 5 SD se excluído do cálculo do TPO médio MFI usando as outras 29 amostras de HC. Ambas as amostras foram, portanto, consideradas “positivas” em nossa análise, mas as incluímos no cálculo do ponto de corte de 5 DP nas amostras COVID. Em notável contraste, 25 de 51 (49%) pacientes hospitalizados com COVID-19 tinham autoanticorpos que reconheciam pelo menos um autoantígeno ( Fig. 1 , painel superior) Usando um limite de 5 SD rigoroso, os anticorpos séricos de onze pacientes COVID-19 identificaram um único antígeno, treze reconheceram 2-3 antígenos e um sujeito (Sujeito UP40) reconheceu nove autoantígenos diferentes. As proteínas P ribossomais (P0, P1 e P2) foram os alvos mais proeminentes em pacientes (10 de 50 pacientes, 20%), mas não foram encontradas em nenhum HC. Resultados semelhantes foram observados em 48 indivíduos Kaiser analisados usando um microarray de autoantígeno 26-plex de geração anterior, identificando complexos de autoantígenos contendo RNA sobrepostos incluindo RPP14 Th / To, a partícula Ro / La, a proteína ribonuclear nuclear pequena U1 (U1-snRNP ), antígenos da tireoide e proteínas da cromatina como alvos em pacientes com COVID-19 hospitalizados, mas em nenhum dos HC ( Fig. 4 complementar ).
Antígenos raros observados em pacientes com miosite autoimune (MDA5, Mi-2 e tRNA sintetases como PL-7 e Jo-1), e candidatos a autoantígenos em miocardite autoimune (troponina e MYH6, Fig. 2a ), foram observados em pacientes individuais , assim como autoantígenos de SSc raros (Th / To (RPP25), fibrilarina e o U11 / U12 snRNP, Fig. 2b ). Um subconjunto de autoanticorpos (por exemplo, anticorpos que se ligam ao inibidor do complemento C1q, anticorpos associados à trombose que têm como alvo a glicoproteína 1 beta 2 (2- β GP1) e antígenos associados à vasculite, como a proteína indutora da permeabilidade bactericida (BPI)) que foram implicados na inflamação patogênica em órgãos-alvo, também foram encontrados em pacientes individuais ( Fig. 2c ) 4 – 6 14– 16 . Autoantígenos relativamente comuns, como Scl-70, CENP A / B e Sm / RNP eram raros. Autoanticorpos tireoidianos também foram comumente observados (12/147 indivíduos em todo o nosso estudo, 8,2%, usando pontos de corte de 3.000 MFI e 5 DP acima da HC). Disfunção tireoidiana, que é relativamente comum na população em geral, foi relatada em pacientes com COVID-19 4 , 5 . Em todos os casos em que amostras de mais de um ponto de tempo estavam disponíveis, o anti-TPO e a anti-tireoglobulina (TG) já estavam presentes em níveis elevados de MFI na amostra de linha de base. Tomados em conjunto, esses achados revelam que os pacientes hospitalizados com COVID-19 produzem uma frequência aumentada de autoanticorpos, mas que há uma variação interindividual substancial na qual os autoantígenos são direcionados.
Proteínas secretadas são autoantígenos comuns em pacientes hospitalizados com COVID-19
Em um par de estudos elegantes, Bastard 5 e Wang 17 identificaram independentemente anticorpos anticitocina (ACA) em pacientes com COVID-19 grave. Ambos os grupos mostraram que um subconjunto de ACA impede a ligação de fatores solúveis aos seus receptores de superfície celular cognatos e foi postulado que desempenha um papel patogênico ao impedir as respostas imunes protetoras ao COVID-19. Criamos um array 41-plex compreendendo proteínas secretadas e receptores de superfície celular, modelados em arrays que nós e outros usamos anteriormente para caracterizar anticorpos “secretome” em distúrbios de imunodeficiência 18 , 19 , LES 18 e pacientes com esclerose sistêmica 20 ( Tabela complementar 2) Observamos resultados ainda mais surpreendentes com a matriz de secretoma, que revelou que os anticorpos séricos em 41/51 (80%) dos pacientes COVID-19 hospitalizados reconheceram pelo menos um autoantígeno secretado ou de superfície celular ( Fig. 1 , metade superior direita do painel ) , enquanto apenas 2/31 (6%) indivíduos HC reconheceram um único antígeno (interferon-gama, IFN-γ em um e CD74 no outro, Fig. 1 , metade direita do meio do painel) Curiosamente, o sujeito IFN- + HC γ (HC27) também tinha anticorpos séricos específicos para Sm (uma subunidade do U1-snRNP, usando corte de 5 SD) e para Ro60 e La (usando um corte de 3 SD), sugerindo que “ indivíduo saudável ”está em evolução pré-clínica em direção ao desenvolvimento de LES, uma doença na qual descrevemos anteriormente vários ACA diferentes, incluindo anti-IFN-α e fator de ativação de células anti-B (BAFF).
Os interferons, particularmente o interferon tipo I IFN-α, foram direcionados em vários pacientes COVID em frequências (n = 23 em todos os interferons, 45%) mais altas do que os achados publicados recentemente de outros grupos 17 , 21 . O soro de cinco indivíduos (UP11, UP38, UP41, UP42 e UP46) reconheceu dois ou mais interferons. Em alguns pacientes COVID-19, os valores de MFI foram comparáveis ou mesmo excederam aqueles observados em pacientes protótipos previamente caracterizados com síndrome poliendócrina autoimune tipo 1 (APS-1), proteinose alveolar pulmonar (PAP) e infecções micobacterianas atípicas (AMI) (ver Fig. 3d ).
Muitas interleucinas também foram identificadas como alvos de autoanticorpos nesta tela (por exemplo, interleucinas -1, -6, -10, -15, -17A, -22 e -31), assim como as citocinas com funções bem caracterizadas, como inibidoras de leucemia fator (LIF), a proteína-1 alfa inflamatória quimiocina macrófago (MIP-1α) e fator de crescimento endotelial vascular-B (VEGF-B). Várias reatividades marcantes foram observadas em pacientes individuais com COVID-19, incluindo IL-12p70 (sujeito UP47); a enzima conversora de angiotensina-2 do receptor SARS-CoV-2 (ACE-2, sujeito UMR19); fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos que é o alvo de autoanticorpos causadores em PAP (GM-CSF, sujeito UP25); oncostatina-M (OSM, sujeito UP40); e ativador do receptor solúvel do fator nuclear kappa B (ligante sRANK, sujeito UP19).Fig. 1 ). A MFI para todos os antígenos, exceto IL-12p70, foi muito alta (> 10.000) em pacientes individuais. Autoanticorpos contra todas as interleucinas, citocinas e ACE-2 identificados na triagem inicial também foram observados usando um ponto de corte de 5 SD em uma segunda coorte COVID-19 (n = 98 amostras longitudinais de 48 pacientes diferentes, ver Fig. 3 , Figs. Suplementares. 5 e 6 ), com poucas exceções (por exemplo, IL-1 α, embora IL-1 β tenha sido direcionada usando um ponto de corte de 3 DP; IL-31, que atingiu um ponto de corte de 3 DP; e GM-CSF).
Um subconjunto de autoanticorpos é desencadeado pela infecção por SARS-CoV-2
Para determinar se autoanticorpos e anticorpos anticitocina foram gerados de novo (versus existiam antes da infecção), analisamos 48 pacientes COVID-19 hospitalizados (Stanford University, University of Pennsylvania e Marburg University) nos quais as amostras estavam disponíveis em dois ou mais diferentes pontos no tempo. Vinte e quatro pacientes tinham uma amostra disponível a partir do dia da internação ou t (dia 0). O intervalo entre a coleta da segunda amostra variou de 2 a 58 dias (intervalo médio = 15,8 dias). Dois sujeitos (UP70 e UP71) também tiveram uma terceira amostra sorteada 14-21 dias após a admissão na UTI. Para reduzir os efeitos do lote, todas as amostras em todos os pontos de tempo foram analisadas no 53-plex COVID-19 Autoantigen Array na mesma execução do instrumento ( Fig. Suplementar 5 painel superior ) junto com HC (Suplementar Fig. 5, painel do meio, n = 16) e amostras de soro do protótipo de doenças autoimunes serviram como controles positivos ( Suplementar Fig. 5, painel inferior , n = 8).
Tal como acontece com as amostras não emparelhadas descritas na Fig. 1 , os autoanticorpos de pacientes com amostras emparelhadas apresentaram MFIs elevados em pacientes individuais. Alguns pacientes foram identificados novamente, cujo soro reconhecia um grande número de autoantígenos ( Figs. 5 e 6 complementares ). Vinte e cinco (52%) dos pacientes com COVID-19 hospitalizados tinham autoanticorpos contra pelo menos um autoantígeno. Os autoanticorpos séricos reconheceram dois ou mais antígenos (variação de 2 a 7 antígenos) em sete pacientes (15%) ( Fig. 3a e Fig. 6 Suplementar ). A análise longitudinal identificou aumentos proeminentes em autoanticorpos no segundo ponto de tempo disponível ( Fig. 3b ,caixas vermelhas). Em 9 pacientes individuais (19%), as medições de autoanticorpos estavam acima da média para HC no ponto de tempo mais antigo disponível e MFI aumentou em pelo menos 50%, excedendo o ponto de corte de 5 SD e 3.000 MFI no ponto de tempo posterior ( Fig. 3b , por exemplo, MDA5, sujeito UP50; BPI, sujeito UP52; Fig. 6 complementar ). Alguns autoanticorpos estavam na média ou abaixo da média para HC no primeiro momento e aumentaram ao longo do tempo (por exemplo, histonas e histona H3, sujeito UP65; e β 2GP1, sujeitos UP65 e UP52), sugerindo que esses autoanticorpos foram diretamente desencadeados por SARS-CoV -2 infecção. Outros já estavam elevados no primeiro ponto de tempo e não tiveram grandes aumentos na MFI ao longo do tempo (n = 22, 45%, caixas azuis) ( Fig. 3c e Fig. 6 Suplementar) Em um pequeno número de casos, os níveis de autoanticorpos MFI diminuíram abaixo dos pontos de corte de SD e MFI ao longo do tempo (n = 5, 10%, caixas verdes), sugerindo que seu desenvolvimento pode ser transitório (por exemplo, PL-7, sujeito UP70, Fig. 3b ). Anti-TPO e anti-Scl-70 ( Fig. 3c , caixas azuis) permaneceram elevados em níveis elevados em todos os indivíduos soropositivos, independentemente do tempo de medição, sugerindo que esses autoanticorpos já estavam presentes na hospitalização e provavelmente representam pré-clínicos (assintomáticos), autoimunidade não relatada ou não diagnosticada.
Para avaliar melhor a evolução potencial dos autoanticorpos, realizamos o teste de ANA em 21 indivíduos com amostras pareadas. Oito indivíduos (38%) tiveram reatividade ANA positiva ou fraca. Entre esses 8 indivíduos, os ANAs estavam presentes em ambos os momentos em três, mudavam de intensidade de coloração em dois e eram positivos em apenas um dos dois momentos nos três finais ( Fig. 1b complementar ). Tomados em conjunto, esses dados indicam que os níveis de autoanticorpos mudam ao longo do tempo em pacientes individuais com COVID-19, de acordo com sua produção e, em alguns casos, transitórios durante a doença aguda.
Em seguida, examinamos se IgG ACA são desencadeados pela infecção por SARS-CoV-2. Amostras emparelhadas dos mesmos 48 indivíduos descritos acima foram usadas para sondar a matriz de citocinas 41-plex, novamente em uma única execução em lote. Conforme observado com amostras não pareadas ( Fig. 1 ), 28 de 48 (58%) dos pacientes COVID-19 tinham pelo menos um ACA ( Fig. 6 Complementar ). Destes vinte e oito, os soros de quinze pacientes reconheceram uma citocina, cinco reconheceram duas citocinas e oito reconheceram três ou mais citocinas (intervalo de 3-12 antígenos). Interferons, IL-17 e RANK-L foram os alvos mais comuns, e interferons, IL-17 e IL-22 foram novos alvos em alguns pacientes ( Fig. 3d ). Além do sujeito UMR19 ( Fig. 1), um segundo paciente com autoanticorpos ACE-2 de alta MFI também foi identificado (sujeito UMR12, Fig. 3d ). O aumento da MFI foi observado para um ou mais autoanticorpos em momentos posteriores em 12 pacientes (24%). Vários estavam presentes em níveis de MFI próximos ou abaixo da média para HC na linha de base e foram induzidos a altos níveis de MFI no segundo momento (por exemplo, anti-IFN-α, sujeito UMR07; anti-IFN-ε, sujeitos UP63 e UP65; e anti-IL-22, sujeitos UP54, UP63, UP65 e UMR10, Fig. 3d) Em muitos pacientes, os níveis de ACA MFI foram significativamente elevados no primeiro momento e diminuíram no momento posterior, sugerindo que alguns ACA eram pré-existentes e / ou se desenvolveram temporariamente após a infecção por SARS-CoV-2. O sujeito SU09 tinha níveis de MFI muito elevados de anti-TNFα em ambos os pontos de tempo, atribuídos à terapia com anti-TNF. Concluímos que os anticorpos contra citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e receptores são comuns em pacientes com COVID-19 hospitalizados. Muitos são desencadeados em resposta à infecção por SARS-CoV-2, mesmo em momentos posteriores distantes do momento da infecção (por exemplo, anti-IL-22, sujeito UMR10, dia 29, Fig. 3d ).
Para avaliar ainda mais a mudança nos autoanticorpos e ACA ao longo do tempo, realizamos uma análise direcionada de 21 dos 48 pacientes que tinham dados de autoanticorpos e ACA pareados especificamente no D0 e D7 da hospitalização ( Fig. Suplementar 7 ). Quase todos os pacientes (18/21, 86%) apresentaram alterações demonstráveis no número de anticorpos, definidos em limites variáveis de sensibilidade (> 3 DP vs. 3-5 DP vs.> 5 DP) entre D0 e D7 ( Fig. Suplementar 7a ). Ao combinar o número de autoanticorpos ou ACA ( Fig. Suplementar 7b ), há uma tendência para o aumento do número de autoanticorpos e ACAs por sujeito ao longo do tempo. Foi observado um maior número de indivíduos com mais autoanticorpos e ACAs em D7 em comparação com D0 no limiar de 3-5 SD (Suplementar Fig. 7b e 7c ), mas a diferença nas medianas entre D0 e D7 não foi estatisticamente significativa. No entanto, esses dados mostram claramente que há uma evolução contínua tanto no número quanto nos níveis de autoanticorpos e ACAs com o tempo em pacientes com COVID-19 hospitalizados.
As amplas respostas imunes antivirais têm como alvo as proteínas virais internas em pacientes COVID-19 hospitalizados
Usamos arranjos de proteínas para mapeamento de epítopos e para medir as respostas de anticorpos em vacinas contra influenza 22 e em um estudo de vacina contra o vírus da imunodeficiência humana primata (HIV) 23 . Usamos uma abordagem semelhante aqui para caracterizar as respostas antivirais após a infecção por SARS-CoV-2. Criamos um array viral COVID-19 de 28 plex que incluía proteínas estruturais e de superfície do SARS-CoV-2, bem como oito proteínas não estruturais recombinantes disponíveis comercialmente localizadas no interior do vírus ( Tabela Suplementar 3 ). Como uma validação inicial, comparamos a detecção e medição baseadas em array usando um ELISA de grau clínico (R = 0,81, Spearman, p <0,0001 para o nucleocapsídeo anti-SARS-CoV-2; R = 0,60, Spearman, p <0,0001 para anti -SARS-CoV-2 RBD,Suplementar Fig. 8a e 8b, respectivamente ). Ao estudar a resposta do anticorpo antiviral (AVA), esperamos entender se certos antígenos virais podem se correlacionar com o desenvolvimento de respostas autoimunes. Nossa hipótese é que a infecção por SARS-CoV-2 mal controlada leva ao desenvolvimento de anticorpos séricos que reconhecem não apenas proteínas estruturais, como a proteína spike SARS-CoV-2, mas também proteínas não estruturais, e que um subconjunto dessas proteínas virais pode se correlacionar com o desenvolvimento da autoimunidade. Proteínas de coronavírus relacionados também foram incluídas para explorar se os anticorpos pré-existentes para coronavírus sazonais podem se correlacionar negativamente ou positivamente com a gravidade da doença e com a autoimunidade.
A Fig. 4 mostra uma representação de mapa de calor da reatividade de IgG com base em MFI ( Fig. 4a , painel esquerdo ) e cálculo de SD acima da média de MFI para HC ( Fig. 4b , painel direito ). Como esperado, quase todos os pacientes tinham grandes respostas imunitárias a proteínas estruturais virais (primeiros sete antigénios sobre a esquerda, Fig. 4a e b ). Doze pacientes tiveram níveis baixos de MFI no ponto de tempo mais antigo (quase todos foram no dia 0, definido como coleta dentro das primeiras 24-72 horas de hospitalização, mas desenvolveram anticorpos IgG SARS-CoV-2 de MFI elevados quando testados em pontos de tempo posteriores, consistente com descobertas publicadas anteriormente no contexto de doença aguda 24 ( Fig. 4a) Outros sujeitos (por exemplo, sujeito UP50) já tinham respostas amplas de AVA no dia 0, sugerindo que haviam sido infectados por um período significativo de tempo antes da admissão hospitalar.
Os níveis de anticorpos IgG contra as proteínas não estruturais SARS-CoV-2 foram significativamente elevados na maioria dos pacientes (n = 35, 73%), particularmente protease semelhante à papaína (PLPro, n = 13 pacientes), proteínas do quadro de leitura aberta (Orf 8, n = 14 pacientes e Orf 3a, n = 18 pacientes); e proteínas não estruturais (NSP 1, n = 20 pacientes e NSP 9 n = 31 pacientes, mas não NSP 7 (n = 0), NSP8 (n = 1) ou protease semelhante a 3C (n = 3)). O número de proteínas não estruturais direcionadas aumentou ao longo do tempo em 20 de 49 (40%) pacientes quando comparado com o ponto de tempo mais antigo disponível, e estavam ausentes (n = 14), não mudaram (n = 7) ou diminuíram ( n = 8) nos demais pacientes. Dos oito pacientes que mostraram uma diminuição no número de antígenos SARS-CoV-2 não estruturais direcionados ao longo do tempo, todos, exceto um, diminuíram por um único antígeno, e três eram pacientes cujas amostras foram coletadas em um intervalo de 37 dias, tornando provável que as respostas imunológicas fossem transitórias. A maioria dos pacientes tinha respostas de anticorpos vinculadas nas quais vários antígenos não estruturais eram direcionados ao mesmo sujeito. Em pacientes raros (por exemplo, sujeito UP65, consulte proteína PLpro SARS-CoV-2,Fig. 4a e 4b ), a resposta imune inicial foi focada em uma proteína interna (ou era pré-existente) e posteriormente evoluiu para spike alvo e outras proteínas de superfície ou estruturais de SARS-CoV-2. Concluímos que as respostas de anticorpos em pacientes com COVID-19 hospitalizados não se limitam a proteínas estruturais, que respostas ligadas a várias proteínas não estruturais são observadas ao longo do tempo e que NSP9 é a proteína interna SARS-CoV-2 mais comumente reconhecida dentre as testadas na matriz.
Novos autoanticorpos IgG de início estão temporariamente associados com respostas anti-SARS-CoV-2 IgG
Em seguida, identificamos um subgrupo de pacientes (n = 12) cujas respostas de anticorpos anti-SARS-CoV-2 sugeriram que eles haviam sido infectados em um ponto de tempo próximo à hospitalização e captura da primeira amostra. Os critérios de seleção para pacientes que estavam no início de suas respostas antivirais incluíram (i.) A primeira amostra disponível foi dentro de três dias de hospitalização; (ii.) os níveis de IgG anti-pico S1 eram <5.000 MFI no início do estudo; (iii.) os níveis de IgG anti-RBD eram <20.000 MFI no início do estudo; e (iv.) foi observado um aumento de pelo menos 2 vezes em MFI para IgG contra S1 e RBD no próximo ponto de tempo disponível. Em seguida, estudamos esses pacientes para determinar se novos autoanticorpos IgG apareceram no segundo momento, fornecendo evidências de que o SARS-CoV-2 desencadeia diretamente o desenvolvimento de autoanticorpos.
Comparamos as reatividades de IgG em ambos os pontos de tempo para todos os doze indivíduos que preencheram os critérios acima em arranjos de autoantígenos COVID-19 ( Fig. 5a , painel esquerdo ) e arranjos de citocinas ( Fig. 5b , painel do meio ) com respostas antivirais usando o vírus matriz ( Fig. 5c , painel direito) Quatro de doze pacientes apresentaram pelo menos um autoanticorpo induzido recentemente no momento posterior (caixas brancas). Dois desses quatro pacientes tinham dois ou mais novos autoanticorpos (sujeitos UP52, n = 5 antígenos; e sujeito UP65, n = 10 antígenos). β2GP1, histonas e o componente de 54 kD da partícula de reconhecimento de sinal de autoantígeno de miosite (SRP 54) foram os antígenos mais comuns identificados (n = 2 indivíduos cada). Dado o pequeno tamanho da amostra, nenhuma correlação clara foi identificada entre os autoanticorpos individuais e uma resposta IgG a uma proteína viral específica ( Fig. 5d e Fig. 9 complementar ).
Finalmente, correlacionamos autoanticorpos e ACA com respostas de IgG antiviral usando dados de matriz da coorte descrita na Fig. 3, concentrando-se em amostras de Penn e Marburg que foram coletadas em momentos o mais próximo possível do dia da hospitalização. Comparamos pacientes que tinham um ou mais autoanticorpos (n = 15 primeiro ponto no tempo, n = 13 segundos no tempo) com pacientes que não tinham autoanticorpos (n = 21 no primeiro ponto no tempo, n = 23 segundos no tempo). O RBD anti-SARS-CoV-1 correlacionou-se positivamente com o grupo de autoanticorpos positivos (p = 0,002 no segundo momento usando o teste de soma de postos de Wilcoxon, p = 0,044 usando a correção de Bonferroni para cada ponto de tempo). NSP1 (p = 0,03 no segundo ponto de tempo, p = 0,08 no primeiro ponto de tempo) e ME (p = 0,04 no primeiro ponto de tempo; p = 0,06 no segundo ponto de tempo) tenderam positivamente ao se correlacionar com autoanticorpos, mas não foram estatisticamente significativos ao corrigir para várias hipóteses. Uma análise idêntica foi realizada em pacientes ACA + vs. ACA-,
Discussão
Usamos uma plataforma multiplexada baseada em esferas para identificar anticorpos circulantes em pacientes hospitalizados com COVID-19 e geramos resultados integrados de três microarranjos de proteínas diferentes para descobrir autoantígenos associados a COVID-19 e vinculá-los a respostas antivirais. Nossos estudos levaram a vários achados importantes que fornecem informações adicionais sobre a patogênese do COVID-19. Em primeiro lugar, descobrimos que aproximadamente metade dos pacientes com COVID-19 hospitalizados desenvolve autoanticorpos séricos contra um ou mais antígenos em nosso array, embora apenas um quarto de todos os pacientes sejam ANA +. Níveis aumentados de autoanticorpos não são simplesmente um reflexo da hipergamaglobulinemia porque são produzidos desproporcionalmente à concentração sérica de IgG total. Na maioria dos indivíduos, apenas um pequeno número de autoantígenos são direcionados, o que é mais consistente com uma perda esporádica de autotolerância do que com um aumento global na produção de autoanticorpos. Em segundo lugar, os autoanticorpos que descobrimos são encontrados em doenças do tecido conjuntivo relativamente raras que não são normalmente medidas em laboratórios clínicos, e alguns são considerados patogênicos. Terceiro, um número surpreendentemente grande de ACA foi identificado, muito mais do que apenas os autoanticorpos de interferon descritos recentemente21 . Em quarto lugar, foram identificados anticorpos que reconhecem proteínas não estruturais SARS-CoV-2 que se correlacionam positivamente com autoanticorpos. Finalmente, e talvez o mais importante, alguns autoanticorpos são desencadeados pela infecção por SARS-CoV-2, sugerindo que COVID-19 grave pode quebrar a tolerância ao próprio.
Aproximadamente 60-80% de todos os pacientes com COVID-19 hospitalizados em nosso estudo tinham pelo menos um ACA, com um número maior de diferentes especificidades ACA geradas em pacientes individuais do que o observado para autoantígenos tradicionais. Dois estudos recentes demonstraram que os ACA bloqueadores de IFN-α e IFN-ω são encontrados em pacientes com COVID-19 grave 21 , 25 . Anticorpos anti-IFN com atividade bloqueadora estavam ausentes em todos os 663 pacientes testados com COVID-19 leve, relacionando fortemente a presença de anti-IFN à patogênese e gravidade da doença 21 . Outro estudo relatou que a deficiência de interferon tipo I (IFN) pode ser uma marca registrada de COVID-19 grave 26, enquanto outros pesquisadores apontaram para uma resposta imune antiviral desafinada devido ao retardo da expressão do interferon tipo I / III 27 . Bastardo identificou o bloqueio de ACA para citocinas adicionais, incluindo IL-6, IL-22 e IL-12p70 21 . ACA sem atividade de bloqueio ainda pode ser biologicamente importante, por exemplo, potencializando a ligação ao receptor ou prolongando a meia-vida da citocina 28 , 29 . Em outro estudo recente, Wang identificou autoanticorpos contra proteínas adicionais secretadas e associadas a tecidos em pacientes com COVID-19 17, alguns dos quais eram patogênicos quando testados em modelos animais de infecção por SARS-CoV-2. Autoanticorpos pré-existentes contra IFN-α foram identificados recentemente em 4/10 (40%) pacientes com LES da coorte de LES do NIH que mais tarde foram infectados com SARS-CoV-2 32 . Identificamos ACA no LES (incluindo anticorpos bloqueadores anti-BAFF e anti-IFN α) 18 , esclerose sistêmica 30 e uma variedade de distúrbios de imunodeficiência 18 , 19 , 31, sugerindo que os ACA são provavelmente mais comuns do que anteriormente apreciado em doenças imunomediadas. Tomados em conjunto, esses estudos anteriores são consistentes com a noção de que os ACA pré-existentes são patogênicos e podem colocar esses indivíduos em risco aumentado de desenvolver COVID-19 grave. O que difere em nosso trabalho desses estudos anteriores é que mostramos uma mudança nos níveis e no número de ACA ao longo do tempo em muitos indivíduos hospitalizados com COVID-19 agudo. Nossos achados sugerem que o ACA também pode se formar em resposta à infecção viral ou como consequência de uma resposta imune inflamatória na qual altos níveis de citocinas são gerados.
Além de os ACAs modularem a resposta imune e potencialmente causar uma inflamação mais destrutiva, os autoanticorpos têm o potencial de contribuir de várias outras maneiras para a patogênese do COVID-19. Vários autoantígenos que descobrimos são naturalmente complexados com uma molécula de RNA estrutural que poderia servir como um ligante para sensores de ácido nucléico, como Toll Like Receptors (por exemplo, TLR7, TLR3) em células hospedeiras. O RNA ou DNA liberado de células que estão morrendo também podem formar complexos imunes com antígenos virais ou próprios que podem promover a produção de autoanticorpos. Um subconjunto de autoantígenos identificados por array (por exemplo, MDA5) é codificado por genes induzíveis por interferon e seria previsto para ser transcrito em resposta à infecção por SARS-CoV-2. Na verdade, a fase aguda da infecção grave por SARS-CoV-2 pode ser acompanhada por marcada inflamação do tecido, tempestade de citocinas (incluindo secreção de interferons), regulação positiva das vias de sinalização de interferon e expressão de ACE-2 no endotélio vascular. Embora ainda não explorados para autoanticorpos associados a COVID-19 ou ACA, os anticorpos IgG que se ligam às proteínas SARS-CoV-2 são frequentemente IgG1 e possuem glicanos afucosilados. Essas propriedades aumentam as interações da imunoglobulina com o receptor Fcγ de ativação FcγRIIIa, potencialmente levando ao aumento da produção de citocinas inflamatórias, como IL-6 e TNF33 .
Postulamos que um subconjunto dos autoanticorpos que identificamos contribui para a formação de complexos imunes inflamatórios in situ , particularmente nas superfícies endoteliais. Por exemplo, armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) foram implicadas em pacientes com COVID-19 com vasculite. 34 A vasculite associada ao Anticorpo Citoplasmático Antineutrófilo (ANCA) (AAV) tem sido fortemente associada à ativação de neutrófilos e geração de NETs pró-inflamatórios contendo ácidos nucleicos, histonas e peptídeos inflamatórios 35. Embora não tenhamos observado níveis elevados de MPO ou PR3, identificamos anticorpos anti-BIP de MFI elevados em 6% dos pacientes com COVID-19. A detecção de autoanticorpos para BIP e core, bem como histonas ligantes, levanta a possibilidade de que NETs contribuam para a geração de autoanticorpos em COVID-19 grave, uma possibilidade que está em linha com a neutrofilia que acompanha a doença aguda grave 36 . A coagulopatia microvascular disseminada e a lesão microvascular no pulmão e na pele de pacientes com COVID-19 se correlacionam com deposição de fibrina e formação de trombo 37 . As proteínas de membrana SARS-CoV-2 incluindo a proteína spike (mas não o RNA SARS-CoV-2) colocalizam com complemento ativado em endotélio microvascular ACE-2 + de tecido pulmonar COVID-19 e pele de aparência normal 37 ,38 . Magro e colegas levantam a hipótese de que a proteína spike na superfície dos pseudovirions circulantes se liga à ACE-2 endotelial (cujo gene é indutível pelo interferon), fornecendo um nicho para a ativação do complemento e formação de microtrombos. Anti-C1q (um autoantígeno SLE), anti-β 2GP1 (que é trombogênico), anti-BPI e anti-ACE-2 (se não bloqueador) 39 que foram descobertos em nossa tela seriam previstos para exacerbar esses processos patogênicos 40 .
A infecção grave também pode resultar em uma resposta imune “com todas as mãos no campo” que resulta em perda de tolerância devido à presença de mediadores pró-inflamatórios que podem diminuir a necessidade de ajuda de células T. Alguns pacientes com COVID-19 agudo grave parecem apresentar respostas de células B extrafoliculares que são caracterizadas por células B expandidas e plasmablastos, perda de centros germinativos e perda de expressão de Bcl-6 41 , 42 . Os repertórios de anticorpos analisados de pacientes com COVID-19 hospitalizados durante a doença aguda incluem clones maciços com baixos níveis de mutação somática (SHM) 43 , 44 e sequências CDR3 alongadas que podem estar associadas à polirreatividade 45 e são uma reminiscência das respostas imunes vistas no Ebola agudo46 e infecção por salmonela 47 . Foi sugerido que essas respostas se assemelham a crises de SLE nas quais células B autorreativas também são ativadas por meio de uma via extrafolicular dependente de TLR7 8 , 41 , 48 . Embora o RNA genômico SARS-CoV-2 possa servir como um ligante de TLR7 coestimulador, muitos dos autoantígenos que identificamos também se ligam a RNAs estruturais, como o U1-snRNA (encontrado em complexos Sm / RNP), 7S RNA (um componente de SRP), e tRNAs (por exemplo, Jo-1, PL-7 e PL-12) que podem ativar as células dendríticas de uma maneira dependente de TLR7 49 , 50 .
Uma das questões não respondidas mais importantes levantadas por nossos estudos é por que moléculas específicas são direcionadas em pacientes com COVID-19 hospitalizados. Para ACA recém-desencadeado, a explicação mais provável é que eles surgem como consequência de doença grave, juntamente com altos níveis de viremia, lesão de tecido e níveis locais elevados de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias. No entanto, também é possível que a presença de ACA possa afetar a regulação de linfócitos autorreativos, alterando as meias-vidas das interações do receptor das moléculas-alvo. Para os autoantígenos tradicionais, uma possibilidade é que as proteínas virais ou o genoma do RNA do SARS-CoV-2 e as auto-moléculas interajam fisicamente, e que a resposta imune inicial à proteína viral em um microambiente altamente inflamatório se expande para incluir proteínas próprias por meio do reconhecimento ligado e da propagação do epítopo intermolecular. Outra possibilidade é o mimetismo molecular no qual uma ou mais proteínas virais ou epítopos reagem de forma cruzada com as próprias proteínas, levando à perda de tolerância e desenvolvimento de autoimunidade51 , 52 . Experimentos para explorar esses mecanismos estão em andamento.
A grande maioria dos estudos sobre as proteínas SARS-CoV-2 tem se concentrado em proteínas estruturais virais para desenvolver ensaios diagnósticos eficientes e precisos e para identificar epítopos específicos em proteínas de superfície para o desenvolvimento de vacinas e anticorpos monoclonais terapêuticos. Essas proteínas também são o principal foco da resposta imune na maioria dos indivíduos infectados. Aqui, desenvolvemos uma matriz de proteína viral multiplexada que permite a medição simultânea de respostas de anticorpos contra 28 proteínas diferentes de 13 vírus diferentes. Determinamos que as proteínas não estruturais são reconhecidas por anticorpos em uma grande proporção de pacientes COVID-19 hospitalizados, sugerindo que as respostas das células B se expandem ao longo do tempo para envolver moléculas virais adicionais. Os níveis de anticorpos IgG contra NSP1 e ME correlacionaram-se positivamente com a presença de pelo menos um autoanticorpo. Nossa hipótese é que a incapacidade prolongada de erradicar e limpar o vírus expande a resposta imune adaptativa às proteínas virais não estruturais alvo, algumas das quais podem interagir fisicamente ou reagir de forma cruzada com autoantígenos no contexto de um ambiente inflamatório local ou sistêmico intenso, excedendo um limite por quebrar a tolerância para consigo mesmo. Em contraste, os pacientes que montam rapidamente respostas de anticorpos neutralizantes à proteína de pico viral abortam a “disseminação do epítopo intraviral” e podem ter menos probabilidade de desenvolver autoanticorpos. Por que as respostas anti-SARS-CoV-1 RBD IgG se associam a pacientes com autoanticorpos positivos não está claro. Futuros estudos longitudinais são necessários para determinar se as respostas amplas de células B desempenham qualquer papel patogênico direto em pacientes com ciclos hospitalares prolongados ou em pacientes com sequelas de longo prazo de infecção por COVID-19; para correlacionar respostas antivirais com ACA e autoanticorpos ao longo do tempo usando coortes COVID-19 muito maiores, incluindo pacientes assintomáticos ou com doença leve; e explorar se proteínas específicas do SARS-CoV-2 podem apresentar reação cruzada com autoantígenos descobertos em nossas telas.
Muitos estudos de pacientes COVID-19 hospitalizados, incluindo nosso estudo, sofrem de limitações importantes. Em primeiro lugar, existem variáveis de confusão, incluindo dados demográficos heterogêneos, medicamentos na hospitalização, abordagens de tratamento individualizadas e, em alguns casos, história desconhecida de doenças pré-existentes ou doenças autoimunes. Em segundo lugar, o “Dia 0” não é o dia 0 da infecção, mas, em vez disso, refere-se a um momento mais próximo à hospitalização. Nossos resultados de matriz viral ( Figs. 4 e 5) confirmam que o tempo entre a infecção inicial e a aquisição da amostra foi heterogêneo, potencialmente confundindo a interpretação dos resultados de autoanticorpos e ACA. Terceiro, nem todos os antígenos (por exemplo, lipídios, proteínas hidrofóbicas e carboidratos) são compatíveis com nossa metodologia de triagem e, como resultado, certamente perdemos algumas reatividades. Quarto, não incluímos pacientes assintomáticos, com COVID-19 leve, vacinados contra a SARS-CoV-2, com outras doenças virais graves ou crianças. Finalmente, nossa análise foi limitada a pacientes hospitalizados durante doença aguda, com tempos de acompanhamento de dias em vez de meses ou anos.
Embora fora do escopo desses estudos, nossos dados geram muito mais questões que precisam ser abordadas nos próximos anos – questões que só podem ser respondidas gerando grandes coortes de indivíduos inscritos prospectivamente com síndromes virais de início recente, incluindo pacientes com COVID- 19, doenças respiratórias que se assemelham a COVID-19 e indivíduos inscritos em ensaios de vacinas COVID-19. Os autoanticorpos e ACAs são específicos para COVID-19 ou sua presença é compartilhada de forma mais ampla em pacientes com influenza e outras doenças agudas graves? Os autoanticorpos e ACAs encontrados em soro de convalescença são usados para tratar pacientes com COVID-19 grave? Algum desses autoanticorpos está subjacente a alguns dos sinais e sintomas observados em “COVID longo”, eles levam a doença autoimune classificável,
Nossos estudos começaram a quantificar o impacto do SARS-CoV-2 na autoimunidade, identificando quais antígenos e doenças autoimunes específicas vigiar em pacientes que foram infectados e contribuindo para o nosso entendimento mecanicista da patogênese do COVID-19. Esses estudos fornecem um ponto de partida para estudos epidemiológicos em grande escala para determinar a extensão da autoimunidade que resulta da infecção por SARS-CoV-2 e os impactos de longo prazo no sistema de saúde e na economia. Embora a pandemia de COVID-19 esteja deixando um rastro de destruição à medida que progride, ela também fornece uma oportunidade sem precedentes para entender como a exposição a um novo vírus poderia quebrar a tolerância a si mesmo, potencialmente dando origem a autoimunidade e outros crônicos, imunomediados doenças.
Métodos
Amostras de soro e plasma
Pacientes hospitalizados com COVID-19
Amostras de soro ou plasma foram obtidas seguindo protocolos aprovados por comitês de revisão institucional locais (IRB) de 147 indivíduos hospitalizados únicos (n = 99 não emparelhados; n = 98 amostras longitudinais emparelhadas de 48 indivíduos distintos). As amostras foram obtidas de quatro centros em três áreas geográficas distintas: Norte da Califórnia (Kaiser Permanente Health Care System, n = 48 amostras não pareadas de indivíduos hospitalizados, IRB # 55718) coletadas em março e abril de 2020; e Stanford Occupational Health Clinic, 20 amostras emparelhadas de 10 indivíduos hospitalizados únicos IRB # 55689) coletados entre abril e junho de 2020; Filadélfia, Pensilvânia (Universidade da Pensilvânia, n = 50 não pareados; e 44 amostras pareadas de 21 indivíduos hospitalizados únicos, IRB # 808542) obtidas entre abril e junho de 2020; eMarburg, Alemanha (Philipps University Marburg, 1 não pareado; e 34 amostras pareadas de 17 indivíduos hospitalizados únicos coletados entre abril e junho de 2020, IRB # 57/20). As características clínicas das coortes podem ser encontradas nas Tabelas Suplementares 4 – 6 .
Controles Saudáveis
Amostras de soro e plasma de controles saudáveis anônimos (HC, n = 41) foram obtidas antes da pandemia de COVID-19 do Stanford Blood Bank e do Stanford Hospital and Clinics.
Conteúdo da matriz de antígeno baseado em grânulos
Criamos três arranjos de antígenos baseados em esferas, personalizados, modelados em arranjos semelhantes que usamos anteriormente para estudar distúrbios autoimunes e de imunodeficiência e para caracterizar as respostas à vacina 18 , 20 , 22 , 53 – 57 . Os antígenos foram selecionados com base em nossos conjuntos de dados publicados; pesquisas na literatura que implicaram antígenos específicos em COVID-19; potencial para contribuição mecanística para a patogênese do COVID-19; e compatibilidade com plataformas baseadas em grânulos. Uma lista completa de todos os antígenos, fornecedores e números de catálogo pode ser encontrada nas Tabelas Suplementares 1 – 3 .
O “COVID-19 Autoantigen Array” incluiu 53 antígenos proteicos comerciais associados a CTDs ( Tabela Suplementar 1 ). O “COVID-19 Cytokine Array” compreendeu 41 proteínas, incluindo citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, proteínas de fase aguda e proteínas de superfície celular ( Tabela complementar 2 ). Proteínas “secretoras” específicas incluíram um subconjunto de moléculas identificadas em grandes triagens anteriores em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) (tela 59-plex) 18 , esclerose sistêmica (esclerodermia ou ES, tela 221-plex, manuscrito em preparação) 30 , Síndrome Polendócrina Autoimune Tipo 1 (APS-1) 18 , Infecções Micobacterianas Atípicas (IAM) 18, Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked (IPEX) 19 , e mais recentemente em COVID-19 9 . O “COVID-19 Viral Array” incluiu 54 proteínas SARS-CoV-2 recombinantes purificadas de fontes comerciais ou proteínas recombinantes produzidas nos laboratórios de vários dos autores (Peter Kim e Taia Wang, Tabela Suplementar 3 ) 33 . Também incluímos proteínas ou fragmentos de proteínas de SARS-CoV-1, Síndrome Respiratória do Oriente Médio (MERS), coronavírus não patogênicos (OC43, 229E, NL63 e HKU1), Hepatite B, Caxumba, Rubéola, Rubeola, Ebola e Influenza (hemaglutinina (HA) de A / California / 07/2009 H1N1).
Construção de matriz
Os antígenos foram acoplados a grânulos magnéticos carboxilados (MagPlex-C, Luminex Corp.) de modo que cada antígeno foi ligado a grânulos com códigos de barras exclusivos, como descrito anteriormente 53 , 58 . Em resumo, a menos que indicado de outra forma, 8 μg de cada antígeno ou anticorpo de controle foram diluídos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e transferidos para placas de 96 poços. Antígenos diluídos e anticorpos de controle foram conjugados a 1 × 10 6 esferas magnéticas carboxiladas por ID. As esferas foram distribuídas em placas de 96 poços (Greiner BioOne), lavadas e ressuspensas em tampão de fosfato (NaH 2 PO 4 0,1 M ,pH 6,2) usando um lavador de placas de 96 poços (Biotek). A superfície do grânulo foi ativada pela adição de 100 μl de tampão fosfato contendo 0,5 mg de 1-etil-3 (3-dimetilamino-propil) carbodiimida (Pierce) e 0,5 mg de N-hidroxissuccinimida (Pierce). Após 20 min de incubação em um agitador, as contas foram lavadas e ressuspensas em tampão de ativação (0,05 M de ácido 2-N-morfolino etanossulfônico, MES, pH 5,0). Os antígenos diluídos e os anticorpos de controle foram incubados com contas por 2 horas em temperatura ambiente. As esferas foram lavadas três vezes em 100 μl de PBS-Tween, ressuspensas em 60 μ de tampão de armazenamento (reagente de bloqueio para Enyzme Linked Immunosorbent Assay, ELISA, Roche) e armazenadas em placas a 4 ° C. A imobilização de alguns antígenos e anticorpos de controle nas IDs de grânulos corretos foi confirmada por análise usando anticorpos monoclonais de camundongo disponíveis comercialmente, ou anticorpos específicos para marcadores de epítopo, como 6X-histidina. Além disso, amostras de plasma humano protótipo derivadas de participantes com doenças autoimunes com padrões de reatividade conhecidos (por exemplo, ds-DNA, Scl-70, centrômero, SSA, SSB, cardiolipina, histonas inteiras e RNP, todos adquiridos na ImmunoVision; também do Stanford Autoimmune Diseases Biobank e OMRF); APS-1, IPEX, PAP ou AMI associado a anticorpos bloqueadores anti-IFN-γ; bem como soros humanos normais (ImmunoVision, Produto # HNP-0300, certificado como não reativo para lisados de células Hep-2 em um título de 1: 100), foram usados para validação.
Sondagem de matriz
Amostras de soro ou plasma foram inicialmente inativadas por calor a 56 ° C por uma hora 59em seguida, testado na diluição 1: 100 em 0,05% de PBS-Tween suplementado com 1% (p / v) de albumina de soro bovino (BSA) e transferido para placas de 96 poços em um layout randomizado. A matriz de esferas foi distribuída em uma placa de 384 poços (Greiner BioOne) por transferência de 5 µl de matriz de esferas por poço. 45 µl dos soros diluídos 1: 100 foram transferidos para a placa de 384 poços contendo a matriz de esferas. As amostras foram incubadas por 60 min em um agitador em temperatura ambiente. As esferas foram lavadas com 3 × 60 µl de PBS-Tween em um lavador de placas (EL406, Biotek) e 50 µl de 1: 500 diluído R-ficoeritrina (R-PE) conjugado com Fcγ IgG F (ab ‘) 2 fragmento humano (Jackson ImmunoResearch) ) foi adicionado à placa de 384 poços para detecção de IgG humana ligada. Após incubação com o anticorpo secundário por 30 min,Instrumento TM (Luminex Corp.). Um mínimo de 100 eventos por ID do grânulo foram contados. Os eventos de ligação foram exibidos como Intensidade Média de Fluorescência (MFI). Para garantir reprodutibilidade e rigor, todas as amostras foram executadas em duplicata em cada experimento. A maioria das amostras foi analisada duas vezes usando o mesmo array executado em dias diferentes, mostrando alta concordância (coeficiente de correlação de Pearson médio 0,94, desvio padrão (DP) 0,09 para um conjunto de dados representativo). O protótipo de soro autoimune também foi inativado pelo calor e comparado com o protótipo de soro autoimune não tratado nas mesmas matrizes, com resultados semelhantes (dados não mostrados).
ELISA anti-dsDNA
O ELISA anti-DNA foi realizado em placas de 96 poços Immobilon revestidas com DNA de timo de vitela (Sigma) que foram então bloqueadas com BSA a 1% em PBS. Diluições de plasmas de paciente e de controle em tampão de bloqueio foram incubadas nas placas de 96 poços revestidas com DNA, Ig não ligada foi lavada e IgG ligada foi medida com conjugado de fosfatase alcalina IgG anti-humana de coelho (Millipore). As amostras foram analisadas em diluições de 1:30, 1:90, 1: 270 e 1: 810. Destas diluições, 1: 270 foi escolhido como ideal para distinguir a ligação de fundo da coloração positiva. Amostras de cinco doadores saudáveis foram testadas nas mesmas condições e um corte arbitrário de 2 × o valor medido mais alto a 1: 270 (que foi de 0,390 unidades arbitrárias) foi usado para distinguir os níveis de ligação positivos dos negativos.
ELISAs anti-mieloperoxidase (MPO) e antiproteinase 3 (PR3)
MPO (Cat # 708705) ou proteinase 3 purificada PR3 (Cat # 708700) pré-ligada aos poços das placas de microtitulação foram adquiridos de Inova Diagnostics (San Diego, CA). Os ensaios foram realizados conforme recomendado pelo fabricante, usando uma diluição de 1: 100 plasma em diluente (fornecido no kit de ensaio). Os controles do ensaio incluíram amostras fortemente positivas, fracas positivas e negativas fornecidas pelo fornecedor. Os controles adicionais incluíram amostras de cinco doadores saudáveis e três pacientes não identificados com níveis clinicamente elevados de anticorpos PR3 e MPO. Os resultados foram classificados como positivos ou negativos com base nas instruções do kit.
ANA e imagem
Os ANAs foram realizados por imunofluorescência indireta usando células Hep-2 fixadas e permeabilizadas afixadas em lâminas de vidro (Inova Diagnostics, Cat # 708100). Os ANAs foram detectados usando um anticorpo IgG anti-humano de cabra conjugado com FITC seguindo as instruções do vendedor. As amostras foram rastreadas de forma cega em uma diluição de 1:80 com microscopia ultravioleta (UV) pela equipe do laboratório clínico (AG e JG) com vasta experiência na interpretação de padrões de ANA. Amostras positivas e positivas fracas foram testadas posteriormente a 1: 160 (a diluição na qual os ANAs são considerados positivos no ensaio de laboratório clínico, que usa o mesmo kit de ensaio). Além dos controles positivos e negativos do kit (incluídos em todas as lâminas), foram utilizadas amostras clínicas desidentificadas de pacientes com ANAs clinicamente detectáveis.
Para análise de imagem ANA, todas as imagens foram coletadas com um Nikon Eclipse Ti com iluminação de campo amplo equipado com uma objetiva de óleo Nikon Plan Apo VC 60 × 1.4. Imagens de fluorescência FITC e Evans Blue foram coletadas com um Chroma dichroic / beamsplitter (parte nº 89402) e uma fonte de luz Chroma quadset CoolLED300, usando FITC 480/30 × excitação e 519 / 26m filtros de emissão, bem como Cy5 640/30 × e filtros de emissão 697 / 60m. As imagens foram adquiridas com uma Câmera Digital Hamamatsu ORCA-ER B&W CCD controlada com o software Metamorph V7.10.3.390 e binning de câmera 1 × 1. Posições de vários estágios foram coletadas usando um estágio codificado linear Ludl XY e um motor Z. Valores de pixel mínimo e máximo definidos para o mesmo nível em uma câmera de 12 bits (4.096 níveis de cinza – FITC 500 min, 2500 max e Cy5 300 min, 1300 max), gama definida como 1,
ELISAs anti-SARS-CoV-2
RBD ELISAs foram realizados conforme descrito em um estudo anterior 60com várias modificações. Proteínas RBD SARSCoV-2 (presente de Scott Hensley) foram revestidas nas placas de ELISA (Cat # 1193A15, Thomas Scientific, Swedesboro, NJ) em uma concentração final de 2 μg / mL em 50 μl de 1 × PBS. Amostras de soro e plasma foram diluídas 1: 100 em tampão de diluição de amostra (PBS-Tween com 1% de leite em pó desnatado por peso) e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. IgG-HRP anti-humano de cabra (Cat # 109-035-008, Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) foi diluído 1: 10.000 com tampão de diluição de amostra e 50 μl de anticorpo secundário foram adicionados a cada poço. Após lavagem 3x (PBS-Tween), as placas foram incubadas durante 0,5 hora à temperatura ambiente e lavadas novamente 3x (PBSTween). 50 μl de substrato TMB (Cat # 555214, Fisher Scientific, Waltham, MA) foram aplicados para o desenvolvimento de cor à temperatura ambiente por 10 minutos e interrompidos com 50 μl de ácido clorídrico 250 mM. Todas as amostras foram testadas em duplicado. Os ensaios do Nucleocapsídeo Anti-SARS-CoV-2 foram executados com um kit comercialmente produzido (Cat # CV3002, LifeSensors, Malvern, PA.) E realizados de acordo com as instruções do fabricante. Amostras de soro e plasma foram diluídas 1: 100 e as placas lidas a DO450 nm. Os ELISAs de RBD e nucleocapsídeo foram repetidos para confirmar os resultados. As placas de ELISA foram lidas a OD450 nm (leitor de placas CLARIOStar, BMG LABTECH Inc., Cary, NC). Amostras de soro e plasma foram diluídas 1: 100 e as placas lidas a DO450 nm. Os ELISAs de RBD e nucleocapsídeo foram repetidos para confirmar os resultados. As placas de ELISA foram lidas a OD450 nm (leitor de placas CLARIOStar, BMG LABTECH Inc., Cary, NC). Amostras de soro e plasma foram diluídas 1: 100 e as placas lidas a DO450 nm. Os ELISAs de RBD e nucleocapsídeo foram repetidos para confirmar os resultados. As placas de ELISA foram lidas a OD450 nm (leitor de placas CLARIOStar, BMG LABTECH Inc., Cary, NC).
Análise estatística
Todas as análises de dados e estatísticas foram realizadas usando R e vários pacotes R 61 . Para normalização, os valores médios de MFI para IDs de “esferas nuas” foram subtraídos dos valores médios de MFI para IDs de esferas conjugadas com antígeno. A média de MFI para cada antígeno foi calculada usando amostras de indivíduos saudáveis não infectados com SARS-CoV-2 (todos obtidos antes de dezembro de 2019). Os anticorpos foram considerados “positivos” se a MFI fosse> 5 DP acima da MFI média para HC para esse antígeno, e a MFI fosse> 3.000 unidades, um limite que é mais rigoroso do que o comumente publicado na literatura relacionada 21 . Um ponto de corte menos estrito de 3 SD usado em um ensaio Luminex para medir imunoglobulinas SARS-CoV-2 no sangue e saliva 62também foi empregado para comparação em alguns experimentos. Um exemplo pode ser encontrado nas Figs suplementares. 3 e 4 . Os dados de ELISA e de número de anticorpos foram visualizados em GraphPad Prism v.9.0.0 (86). Após a publicação deste estudo em um jornal revisado por pares, os dados da matriz desidentificada serão carregados para o banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO).
Disponibilidade de dados
Após a publicação deste estudo em um jornal revisado por pares, os dados da matriz desidentificada serão carregados para o banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO).
Contribuições do autor
SEC, AF, PJU, CS e ETLP projetaram experimentos e painéis de matriz.
SEC e SD realizaram a produção de matriz de antígeno, ACA e matriz viral, controle de qualidade, execuções de amostras e aquisição de dados.
WM, JG, AG, AF, KB e ETLP realizaram e / ou interpretaram ensaios ANA.
WM, IN, MR e ETLP realizaram e / ou interpretaram ELISAs.
TW, SC, PAW, AEP e PSK geraram antígenos chave, forneceram soros pré-caracterizados e auxiliaram na análise de dados e interpretação de ensaios de matriz viral.
WHR gerou reagentes-chave para os arranjos de autoantígenos e AH supervisionado
MG, SG coletou e processou amostras de sangue de pacientes.
MG, SG, EM, SA, NJM, HMG, OO coletaram, extraíram e analisaram dados clínicos.
EM, AN, HR, RG e SC ajudaram na concepção, recrutamento e / ou acompanhamento de coortes de internamento e HC.
JS forneceu amostras pré-caracterizadas de COVID-19 Kaiser Permanente que foram usadas para estabelecer as plataformas de matriz e selecionar autoantígenos para a matriz final.
NJM, EJW projetou as coortes de pacientes internados e HC Penn e obteve financiamento.
HMG, OO, NJM, SA selecionou e inscreveu sujeitos humanos na Penn e coletou biosamostras.
MA, NA e KN supervisionaram o gerenciamento de dados clínicos na clínica CROWN e realizaram análises de prontuários que permitiram a correlação dos resultados da matriz com os parâmetros clínicos.
LB e MA da equipe de pesquisa Stanford CROWN contribuíram com a coleta e armazenamento de amostras de pacientes, coleta de dados laboratoriais e clínicos de pacientes e distribuição de amostras de sangue.
PJ e US forneceram e caracterizaram amostras de sangue de um estudo com interferon lambda em pacientes com COVID-19 leve que foram usadas para estabelecer ensaios e comparar com os resultados de pacientes hospitalizados.
SEC, AF, SD, SA, WM, HR.C., AK, PC, AH, WHR, CS, ETLP e PJU analisaram e interpretaram os dados da matriz.
SEC, AF, SD, SA, WM, CS, ETLP e PJU criaram figuras e tabelas.
SEC, AF, RM, CS, ETLP e PJU escreveram o artigo.
PJU, CS, ETLP, EJW e KN supervisionaram a pesquisa.
CONFLITOS DE INTERESSE
CS recebeu taxas de consultoria e financiamento para pesquisa da Hycor Biomedical e Thermo Fisher Scientific, financiamento para pesquisa da Mead Johnson Nutrition (MJN) e taxas de consultoria da Bencard Allergie.
EJW tem acordos de consultoria com e / ou faz parte do conselho consultivo científico da Merck, Elstar, Janssen, Related Sciences, Synthekine e Surface Oncology. EJW é fundador da Surface Oncology and Arsenal Biosciences. A EJW tem um acordo de licenciamento de patente no caminho PD-1 com a Roche / Genentech.
EM recebeu honorários de consultoria da Roche.
O ETLP recebe financiamento para pesquisa da Janssen Research and Development, taxas de consultoria e financiamento para pesquisa da Roche Diagnostics, é consultor remunerado da Enpicom e atua no conselho consultivo científico da Antibody Society.
NJM reporta financiamento para sua instituição de Athersys Inc, Biomarck Inc e Quantum Leap Healthcare Collaborative, fora do trabalho financiado.
SC relata doações de NIAID, CoFAR, Aimmune, DBV Technologies, Astellas, Regeneron, FARE, e é membro do Conselho Consultivo da Alladapt, Genentech, Novartis, Sanofi e recebeu honorários pessoais da Nutricia.
Todos os autores restantes relatam nenhum conflito de interesse com a pesquisa relatada neste manuscrito. Além das fontes de financiamento, os autores gostariam de agradecer a Sharon Dickow pelo apoio administrativo especializado; pacientes e seus familiares que participaram da pesquisa e forneceram amostras para nossos estudos; as muitas enfermeiras, médicos, terapeutas respiratórios, provedores de prática avançada e incontáveis funcionários que cuidaram desses pacientes; Alan Landay (Rush University Medical Center) para insights sobre a biologia do COVID-19 e feedback sobre os ensaios; Titilola Falasinnu, Julia Simard, Lisa Zaba, Matt Baker, Yvonne Maldonado, Scott Boyd e Lori Chung pelas discussões úteis; Jennifer Okwara pela assistência com a análise de imagens de imunofluorescência indireta de ANA; e Scott Hensley por fornecer o antígeno RBD para o ELISA.
LEGENDAS DE FIGURAS COMPLEMENTARES
Suplementar Fig. 1: Coloração de Anticorpo Anti-Nuclear (ANA) na coorte de pacientes COVID-19 da Universidade da Pensilvânia. uma. Resultados de imunofluorescência indireta de IgG ANA em um título de triagem de 1:80, com positivos confirmados em 1: 160. O gráfico de pizza mostra o número de pacientes (n = 73 no total), codificados por cores por força da coloração e padrão. b. Análise dos dados de ANA em amostras pareadas obtidas em 21 pacientes mostrando o número de pacientes cujos ANAs mudam ao longo do tempo. d. Imagens de ANAs positivos de indivíduos individuais, mostrando padrões de coloração difusos (esquerda), nucleolares (meio) e pontilhados (direita). Digno de nota, UP01 também foi fracamente positivo para anticorpos dsDNA.
Suplementar Fig. 2: IgG ELISAs de vírus e ligação a autoantígenos. Ligação de anticorpos IgG ao domínio de ligação do receptor SARS-CoV-2 (RBD), nucleocapsídeo e autoantígenos (DNA de fita dupla (dsDNA), mieloperoxidase (MPO) e proteinase 3 (PR3)). Cada símbolo representa um paciente (N = 73). Para as disciplinas em que havia dois ou mais pontos no tempo, foi escolhido o ponto no tempo D7, exceto para o assunto UP68, em que foi escolhido o ponto no tempo D14. UP01 teve um resultado dsDNA fracamente positivo. UP43 foi positivo para PR3.
Figuras complementares relacionadas à Figura 1.
Suplementar Fig. 3: Mapa de calor de MFI correspondente à Figura 1 .
Suplementar Fig. 4: Validação na coorte Kaiser Permanente. Mapa de calor de desvio padrão representando anticorpos IgG séricos descobertos usando uma matriz de proteína baseada em grânulo 26-plex de primeira geração contendo os autoantígenos indicados (eixo y). Os autoantígenos são agrupados com base na doença (esclerodermia, LES / Sjögren, cirrose biliar primária (PBC) / tireóide, nucleossomos e antígenos associados à inflamação do tecido. Pacientes COVID-19 de Kaiser Permanente (painel esquerdo, n = 48). HC (n = 10, painel do meio) e 7 doenças autoimunes protótipo (painel direito) são mostrados. As cores indicam autoanticorpos cujas medições MFI são> 5 SD (vermelho), <5 ou> 3 SD (rosa) ou <3 SD (preto) acima a média de MFI para HC. MFIs <5.000 foram excluídos.
Figuras suplementares relacionadas à Fig. 3:
Suplementar Fig. 5 : Evolução do desenvolvimento de autoanticorpos IgG ao longo do tempo em pacientes com COVID-19 hospitalizados. uma. Mapa de calor usando a mesma matriz de proteínas baseada em esferas de 53 plex apresentada na Figura 1 , contendo os autoantígenos indicados (eixo x). Os autoantígenos são agrupados com base na doença (esclerodermia, miosite e síndromes de sobreposição, como MCTD, LES / Sjögren, distúrbios gastrointestinais e endócrinos), antígenos associados ao DNA e antígenos associados à inflamação do tecido ou respostas ao estresse. Pacientes COVID-19 (painel superior, n = 98 amostras longitudinais de COVID-19, incluindo 92 amostras emparelhadas de 46 sujeitos e dois sujeitos que tinham três pontos de tempo disponíveis cada, sujeito UP70 e UP71). HC (n = 16, painel do meio) e 8 protótipos de doenças autoimunes (painel inferior) são mostrados.b. Mapa de calor usando uma matriz de 41 plex de citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento e receptores. As mesmas amostras no Painel A também foram analisadas para ACA. As citocinas são agrupadas no eixo x por categoria (interferons, interleucinas e outras citocinas / fatores de crescimento / receptores). As amostras de protótipo de pacientes com distúrbios de imunodeficiência incluem três pacientes com APS1, um paciente com PAP e três pacientes com IAM. As cores correspondem aos valores MFI mostrados na extrema direita.
Fig. 6 complementar: Mapa térmico de desvio padrão de MFI correspondente à Figura 3.
Suplementar Fig. 7: Número de anticorpos em 21 indivíduos com dados de ponto de tempo D0 e D7 emparelhados, estratificados por categoria de reatividade. uma. Mapa de calor de assuntos individuais. As linhas denotam assuntos e pontos de tempo em dias (dia 0, D0 e dia 7, D7). As colunas denotam autoanticorpos (AutoAb) e anticorpos anticitoquina (ACA). Os anticorpos estão acima de 5 desvios padrão em comparação com controles saudáveis agrupados (5 DP) ou entre 3 e 5 desvios padrão (3 DP). Os glóbulos brancos indicam 0 anticorpos. b.Contagens de anticorpos em D0 e D7 estratificadas por categoria de anticorpos. As contagens de autoanticorpos (AutoAb, azul) e anticorpos anti-citocina (ACA, amarelo) são mostradas para os mesmos 21 indivíduos no Dia 0 (esquerda) e no Dia 7 (direita). As contagens foram baseadas em anticorpos que estavam presentes em níveis entre 3 e 5 DP acima da média de MFI para amostras de controle saudáveis. c.Anticorpos por sujeito mostrados para diferentes níveis de corte de anticorpos. 5 DP => 5 DP acima da média MFI para o grupo HC; 3 DP => 3 e <5 DP acima da MFI média para HC; No SUM, os dados de 5 e 3 SD foram adicionados separadamente para cada indivíduo. Esta categoria representa todos os anticorpos detectados em 3 SD ou superior. AutoAb = autoanticorpos; ACA = anticorpos anticitocina. Linhas vermelhas horizontais indicam medianas. Cada símbolo representa um assunto. Os valores de P são calculados usando o teste de soma de postos emparelhados de Wilcoxon. Apenas D7 AutoAb vs. D7 ACA foram significativos (p <0,05) para os níveis de anticorpos 3 SD e SUM.
Figuras suplementares relacionadas às Figs. 4 e 5 :
Suplementar Fig. 8: Comparação entre ELISA e ensaios baseados em esferas. a e b. Análise de correlação entre ELISA e dados multiplex bead. Todas as amostras (incluindo vários pontos de tempo de indivíduos individuais) foram incluídas na análise de correlação (N = 57 amostras de 35 indivíduos). Cada símbolo representa uma amostra com a intensidade média de fluorescência (MFI) vs. a densidade óptica (OD). As correlações de Spearman foram calculadas com valores de p bicaudais. ce d . Dois gráficos de linha representativos para 21 pacientes com amostras pareadas em D0 e D7. Os anticorpos IgG aumentaram ao longo do tempo para RBD (p = 0,042, teste de soma de postos de Wilcoxon), mas não mudaram com o tempo para Nucleocapsídeo (p = 0,73, NS, teste de soma de postos de Wilcoxon).
Suplementar Fig. 9: Gráficos de barras de MFI para autoantígenos individuais e antígenos virais para os quatro pacientes com um ou mais autoanticorpos desencadeados recentemente, correspondendo à Figura 5 . As barras de erro representam um desvio padrão do MFI para réplicas de amostra.
TABELAS SUPLEMENTARES
Reconhecimentos
Financiamento
A AEP foi apoiada por uma bolsa de pós-doutorado do Stanford Maternal and Child Health Research Institute.
AF foi financiado pela Universidade de Stanford e pelo Vice Reitor de Educação de Graduação (VPUE) 2019-2020 Major Grant.
AN foi financiado por AH 06-01 (Carreras Foundation).
CS foi financiado pelas Universidades Giessen e Marburg Lung Center e pelo Centro Alemão de Pesquisa Pulmonar, University Hospital Gießen e Marburg (UKGM) financiamento de pesquisa de acordo com o artigo 2, seção 3 do acordo de cooperação, o Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) – financiado – SFB 1021 ( C04), KFO 309 (P10) e SK 317 / 1-1 (número do projeto 428518790), bem como pela Foundation for Pathobiochemistry and Molecular Diagnostics.
EJW foi apoiado pelo NIH concede AI105343, AI112521, AI082630, AI201085, AI123539 e AI117950 para EJWEJW também é apoiado pelo Parker Institute for Cancer Immunotherapy que apoia o programa de imunologia do câncer em UPenn.
ELP foi financiado por NIH UC4 DK112217 e NIH UM1-AI144288 (Centros de Excelência de Autoimunidade, ACE). O ACE é uma rede de pesquisa apoiada pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID / NIH). Agradecemos ao Human Immunology Core, que auxiliou no processamento de amostras COVID-19 e ELISAs, e recebe suporte de infraestrutura do NIH PA30- CA016520 e NIH P30-AI0450080, e do Laboratório de Imunologia Clínica do Hospital da Universidade da Pensilvânia.
EM foi financiado pela Stiftung PE Kempkes (06/2014, 01/2016), Deutsche José Carreras Leukämie- Stiftung (18R / 2016), Rhön Klinikum AG (RKA No. 64).
HG foi apoiado por T32 HL007586.
O RH foi financiado pelas Universidades Giessen Marburg Lung Center e pelo Centro Alemão de Doenças Pulmonares (DZL German Lung Center, no. 82DZL00502) para UGMLC.
IN foi apoiado pelo prêmio UTHSC / UofM SARS-CoV-2 / COVID-19 Research CORNET.
KN foi apoiado pelo NIH Grant 5U19AI057229-17 e pelo apoio filantrópico do Sean N Parker Center COVID-19 Research Fund.
MA foi financiado pelo Sean N Parker Center COVID-19 Research Fund.
MR foi financiado pelo prêmio UTHSC / UofM SARS-CoV-2 / COVID-19 Research CORNET.
NJM foi financiado por NIH HL137006 e HL137915, que financiou a inscrição, coleta de biosample e fenotipagem clínica de sujeitos humanos na Penn.
PJU foi apoiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas dos Institutos Nacionais de Saúde, R01 AI125197-04, NIH U01 AI150741-01S1 e o Henry Gustav Floren Trust.
O PSK foi apoiado pelo Chan Zuckerberg Biohub e pelo Frank Quattrone e Denise Foderaro Family Research Fund.
SAA foi apoiado por 1T32AR076951-01, Instituto Allen de Imunologia e Fundo de Pesquisa da Família Chen.
SC foi apoiado por NIH concede UM2 AI130836, UM1 AI130839 e U19 AI104209.
TTW foi apoiado por Chan Zuckerberg Biohub, o Searle Scholars Program, Fast Grants, o CEND COVID Catalyst Fund e o Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de prêmio R01 AI139119, U19 AI111825 e U54 CA260517.
Notas de rodapé
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Endereços de e-mail para autores da UPenn que não sejam ELP:
Wenzhao Meng wmeng@pennmedicine.upenn.edu
Sokratis A. Apostolidis Sokratis.Apostolidis@pennmedicine.upenn.edu
Kate Bennett bennk@pennmedicine.upenn.edu
Amanda Finck finckam@pennmedicine.upenn.edu
Andrew Gaano Andrew.Gaano@pennmedicine.upenn.edu
Heather M. Giannini Heather.Giannini@pennmedicine.upenn.edu
Joyce Gonzalez Joyce.Gonzalez@pennmedicine.upenn.edu
Oluwatosin Oniyide Oluwatosin.Oniyide@pennmedicine.upenn.edu
Nuala J. Meyer Nuala.Meyer@pennmedicine.upenn.edu
E. John Wherry wherry@pennmedicine.upenn.edu
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Endereços de e-mail para Tennessee:
Marko Radic mradic@uthsc.edu
Indira Neeli ineeli@uthsc.edu
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Endereços de e-mail de autores de Stanford que não sejam PJU:
Sarah Esther Chang sechang@stanford.edu
Allan Feng afeng1@stanford.edu
Maja Artandi mktietze@stanford.edu
Linda Barman lbarman@stanfordhealthcare.org
Iris Chang changi2@stanford.edu
Saborni Chakraborty saborni@stanford.edu
Peggie Cheung pcheung@stanford.edu
Sharon Chinthrajah schinths@stanford.edu
Shaurya Dhingra sdhingra@stanford.edu
Evan Do evando@stanford.edu
Alex Ren Hsu ahsu3494@stanford.edu
Alex Kuo alex0229@stanford.edu
Monali Manohar monali@stanford.edu
Rong Mao rmao@stanford.edu
Abigail Elizabeth Powell aepowell@stanford.edu
Rajan Puri purir@stanford.edu
Payton Anders Weidenbacher paytonw@stanford.edu
Rich Wittman rwittman@stanford.edu
Peter S. Kim kimpeter@stanford.edu
Neera Ahuja nkahuja@stanford.edu
Prasanna Jagannathan prasj@stanford.edu
Kari Christine Nadeau knadeau@stanford.edu
William H. Robinson w.robinson@stanford.edu
Upinder Singh usingh@stanford.edu
Taia T. Wang taiawang@stanford.edu
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Endereços de e-mail para autores de Marburg que não sejam CS:
Margrit Guendisch Guendisc@students.uni-marburg.de
Sarah Greib Greibs@students.uni-marburg.de
Harald Renz harald.renz@uk-gm.de
Reinhard Gessner Reinhard.Gessner@uk-gm.de
Elisabeth Mack elisabeth.mack@staff.uni-marburg.de
Ho-Ryun Chung ho.chung@staff.uni-marburg.de
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Endereços de e-mail de outros autores:
Judith James judith-james@omrf.org
Jeffrey M. Schapiro jeffrey.m.schapiro@kp.org
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