DIAGNOSTICS MEDICINE FOR VIRAL INFECTIONS
Rachel Siqueira de Queiroz SIMÕES1
1Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas, Instituto Oswaldo Cruz. Avenida Brasil, 4.365, Pavilhão Cardoso Fontes, Manguinhos, cep: 21040-900, Rio de Janeiro, Brasil. E-mail: rachelsqsimoes@gmail.com
1Centro de Desenvolvimento Tecnológico em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Avenida Brasil, 4.036, Prédio da Expansão, 80 andar, Manguinhos, cep: 21040-361, Rio de Janeiro, Brasil. E-mail: rachel.simoes@cdts.fiocruz.br
RESUMO
Com os avanços biotecnológicos no campo da virologia é possível descrever os efeitos citopatológicos, detectar partículas virais, isolar vírus em cultivo celular, detectar componentes virais e avaliar resposta imune por meio de inúmeros ensaios laboratoriais. Nesse artigo será destacado algumas técnicas que vem sendo muito utilizadas no diagnóstico de diversas infecções virais tais como: (i) isolamento viral em animais de laboratório, a propagação viral em ovos embrionados e a identificação do vírus em cultura de células; (ii) ensaios sorológicos para detecção de antígenos virais e/ou anticorpos em resposta à infecção viral a partir do teste de neutralização, imunofluorescência; teste imunoenzimático, imunocromatográfico e Western blotting; (iii) detecção direta da partícula viral através da microscopia eletrônica de transmissão; e (iv) amplificação de ácidos nucleicos pelas técnicas de reação em cadeia da polimerase e suas variações, métodos de expressão gênica com o microarranjo de DNA, RNA-seq, sequenciamento de nova geração, abordando ensaios de clonagem e CRISPR.
Palavras-chave: biologia molecular, biotecnologia, diagnóstico, infecção viral, vírus.
ABSTRACT
With biotechnological advances in the field of virology, it´s possible to describe cytopathological effects, to detect viral particles, to isolate virus in cell culture, to detect viral components and to evaluate immune responses through numerous laboratory assays. In this paper, some techniques that have been widely used in the diagnosis of several viral infections will be highlighted, such as: (i) viral isolation in animals laboratory, viral propagation in embryonated eggs and the identification of the virus in cell culture; (ii) serological assays to detect viral antigens and / or antibodies in response to viral infection from the neutralization test, immunofluorescence; immunoenzymatic, immunochromatographic and Westernblotting tests; (iii) direct detection of the viral particle through transmission electron microscopy; and (iv) amplification of nucleic acids by polymerase chain reaction techniques and their variations, methods of gene expression with the DNA microarray, RNA-seq, new generation sequencing, addressing cloning and CRISPR assays.
Key words: molecular biology, biotechnology, diagnosis, viral infection, virus.
INTRODUÇÃO
Dentre as técnicas mais utilizadas no diagnóstico laboratorial de infecções virais destacam-se: (i) isolamento e identificação do vírus em cultura de células; (ii) sorologia para detecção de antígenos virais e/ou anticorpos específicos produzidos pelos hospedeiros em resposta à infecção viral; (iii) detecção direta da partícula viral; (iv) amplificação de ácidos nucleicos.
- Isolamento e identificação viral
No isolamento viral, a escolha do sistema de propagação para o vírus pesquisado é o determinante essencial. Uma vez o vírus inoculado no sistema hospedeiro suscetível, o vírus provoca alterações morfológicas denominadas efeito citopático (CPE, do inglês cytopathogenic effect) que são observadas como alterações na morfologia de células individuais ou em grupo de células induzidas pela infecção viral. Diversos sistemas hospedeiros têm sido utilizados para a propagação de vírus em laboratório como animais de experimentação, ovos embrionados e cultura de células (Santos, 2015).
Animais de laboratório
A propagação viral em animais de laboratório tem sido substituída com o advento do cultivo celular no diagnóstico das infecções virais. Entretanto, podemos citar o uso de camundongos recém-nascidos utilizados no diagnóstico do vírus da Raiva quando inoculados pela via intracerebral (Kimura & Joeler, 2019), coelhos da linhagem Nova Zelândia inoculados experimentalmente com peptídeos sintéticos (Simões et al., 2014) e pesquisas envolvendo primatas não-humanos, como os chimpanzés que podem ser utilizados em ensaios de neurovirulência para o desenvolvimento de vacinas.
Ovos embrionados
Os ovos embrionados foram o sistema hospedeiro de escolha para a propagação de muitos vírus até a década de 1950. A observação da propagação viral em ovos embrionados pode ser realizada a partir da técnica de hemaglutinação (HA) no líquido amniótico ou alantoico, ou mesmo a partir da visualização de lesões esbranquiçadas e/ou hemorrágicas denominadas pocks na membrana corioalantoica, uma vez que a escolha da via de inoculação bem como a idade do embrião são determinadas pela especificidade do vírus a ser isolado (Santos, 2015).
Cultura de células
Por sua vez, a propagação viral em cultura de células geralmente em linhagens bidimensionais (2D) são classificadas com base na morfologia epitelial ou fibroblástica, e de acordo com a sua capacidade de aderência a uma superfície formando uma monocamada ou expandindo em suspensão no meio. Além disso, as linhagens celulares também podem ser classificadas conforme o tipo de cultivo como sendo células primárias, culturas diploides, linhagens contínuas, culturas clonadas e estirpes derivadas de espécies animais.
As culturas de células primárias também chamadas de culturas finitas, de diferentes origens têm sido usadas para o desenvolvimento de vacinas produzidas com vírus atenuados ou inativados. Contudo, a tendência é a substituição para culturas celulares diploides que são provenientes do subcultivo de células primárias com a vantagem de até 100 vezes mais de divisão celular antes de entrar na fase de senescência. Por sua vez, as linhagens de células contínuas ou imortais apresentam crescimento ilimitado e são derivadas do cultivo primário de células de tumor de origem humana ou animal tais como a linhagem de células HeLa (Santos, 2015).
Experimentalmente ensaios de transfecção em garrafas de cultivo 25cm2 e placas de 6 poços contendo células HuH7 (Hepato cellular carcinoma cells) e células da linhagem HEK-293T (Human Embryonic Kidney 293 cells associado ao antígeno T do Simian Virus-40) em meio com baixa concentração de glicose (Low glucose) e com alta concentração de glicose (High Glucose) respectivamente, foram analisadas experimentalmente para o vírus da hepatite C (HCV) (Simões, 2011).
Ademais, existem as culturas clonadas que é gerada a partir de uma população de células derivadas de uma única célula (clone) com base na expressão de características específicas de interesse. Em contraste, existe a metodologia de cultura de células tridimensionais (3D) demonstrando maior semelhança com o comportamento fisiológico das células in vivo e heterogeneidade celular (Sousa, 2016).
- Diagnóstico sorológico das infecções virais
Dentre os métodos sorológicos utilizados na virologia destacam-se: (i) teste de neutralização, (ii) imunofluorescência direta e indireta; (iii) teste imunoenzimático (Elisa); (iv) teste imunocromatográfico; (v) immunoblotting ou Western blotting.
Teste de neutralização
O teste de neutralização por redução de placas (PRNT, do inglês plaque-reduction neutralization test) pode ser utilizado para identificação do antígeno viral ou para avaliação do nível de anticorpos como demonstrado por Magnani e colaboradores. Experimentalmente, amostras de soro de primatas não-humanos que receberam ou não anticorpos monoclonais foram investigados quanto a capacidade de neutralizar o vírus Zika (Magnani et al., 2017).
Imunofluorescência
A técnica de imunofluorescência utiliza anticorpos marcados com corantes fluorescentes para revelar a formação de um imunocomplexo vírus-anticorpo. Existem dois tipos de imunofluorescência: direta (usada para identificação de muitos antígenos virais) e indireta (usada para identificação de antígenos ou anticorpos). Um exemplo clássico do vírus da Raiva é a detecção direta com o uso do fluorocromo que ao ser excitado por uma luz ultravioleta emite uma fluorescência verde-amarelo brilhante permitindo a visualização de antígenos virais rábicos (Kimura & Junior, 2019).
Imunoenzimático
A reação imunoenzimática também denominada ELISA, do inglês Enzyme Linked Immunosorbent Assay, envolve as etapas de formação de imunocomplexo (antígeno-anticorpo), adição do conjugado (anticorpo-enzima), sucessivas lavagens e posterior revelação (adição do substrato e reação de cor). A leitura do ensaio é realizada pela absorbância após a adição da solução de interrupção (stopping solution) através do espectrofotômetro. Peptídeos foram sintetizados e testados em ensaios de sensibilização de placas de Elisa para a análise do diagnóstico in vitro em amostras de coelhos imunizados. Em outros ensaios foram analisados os sobrenadantes e lisados de células para à avaliação da presença de HBsAg juntamente com amostras de pacientes soros positivos para o vírus da hepatite C (HCV) (Simões et al., 2011).
Imunocromatográfico
O teste imunocromatográfico também chamado lateral flow immunochoromatographic assay ocorre por capilaridade em uma membrana de nitrocelulose pelo fluxo lateral da amostra. É um teste rápido e de fácil detecção com diversas opções disponíveis comercialmente. A interpretação do resultado é simples sendo considerado positivo quando as duas linhas (teste e controle) são detectadas indicando que o vírus presente na amostra reagiu com o conjugado formando um imunocomplexo. Nova reação ocorre com um outro anticorpo vírus-específico gerando uma banda visível. Por outro lado, o resultado é negativo quando somente a linha controle estiver visível e no caso de nenhuma linha ser visualizada, o teste deverá ser invalidado (Santos, 2015).
Immunoblotting ou Western blotting
Immunoblotting é um teste altamente sensível e específico gerando interpretações subjetivas em alguns resultados. Consiste na separação de proteínas virais por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) contendo o detergente duodecil sulfato de sódio (SDS). As proteínas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose para detecção de anticorpos conjugados com enzima e posterior revelação do substrato associado a um cromógeno.
Em um dos experimentos, amostras obtidas das transfecções de células foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) utilizando o sistema Miniprotean III (BioRad, USA), conforme instruções do fabricante. Os géis foram corados por coloração com coomassie blue ou utilizando o método com nitrato de prata. Após a eletroforese os géis foram submetidos à transferência para membranas Hybond-P PVDF (GE-HealthCare, Alemanha), utilizando o sistema semi-dry (BioRad, USA) (Simões et al., 2011).
(iii) Detecção direta da partícula viral;
A detecção, visualização e identificação de partículas pseudovirais chamadas particles like-virus (VLP), têm sido analisadas microscopicamente assim como a morfologia ultraestrutural das linhagens celulares SiHa e HeLa por microscopia eletrônica de transmissão (Simões et al., 2015). Para otimização dos resultados, diversos protocolos têm sido descritos e modificados ao longo do tempo. Sumariamente as etapas consistem em embeber as amostras em resina fixadas em glutaraldeído e pós-fixadas em tetróxido de ósmio. Após as sucessivas lavagens em tampão cacodilato, e posterior desidratação em acetona com diferentes concentrações, as células são polimerizadas em resina epóxi e contrastadas em acetato de uranila para as secções ultra-finas no ultramicrótomo (Simões et al., 2016).
(iv) Diagnóstico molecular das infecções virais
Reação em cadeia da polimerase
A reação em cadeia da polimerase, do inglês polymerase chain reaction – PCR, é uma técnica que amplifica sequências específicas do ácido nucleico. Se o genoma é um RNA viral, é necessário converter em DNA complementar (cDNA) utilizando a enzima transcriptase reversa (RT-PCR) para iniciar o processo de amplificação em escala exponencial. A reação cíclica de PCR envolve três etapas clássicas: desnaturação das fitas de DNA, hibridização dos oligonucleotídeos à sequência alvo, e extensão das fitas pela ação da DNA polimerase usando os dNTPs (desoxinucleotídeos trifosfato) como substrato da reação. A enzima DNA polimerase extraída da bactéria Thermus aquaticus, denominada Taq-polimerase é usada para adicionar os desoxirribonucleotídeos a um pequeno segmento de DNA, ou primer, que dirige a síntese do novo segmento de DNA sobre o molde onde o primer se ligar. O DNA das linhagens SiHa e HeLa naturalmente infectadas com HPV-16 e HPV-18, respectivamente tem sido usadas como controle positivo da reação de PCR para detecção molecular do papilomavírus usando os oligonucleotídeos consensus MY09/11 direcionados para o gene ORF L1 amplificando um fragmento de 450 bp (Simões et al., 2016).
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Nesse ensaio, após o background (ruído de fundo) gerado pelas amplificações iniciais, o produto da amplificação marcado com moléculas fluorescentes (SYBR Green) ou sondas (Taqman) emite um sinal de fluorescência que pode ser acompanhado em tempo real até alcançar a curva de melting, e estabilizar na fase plateau quando a emissão de fluorescência é quase nula. A fluorescência gerada por diferentes comprimentos de onda de múltiplos corantes é proporcional à quantidade de produto amplificado na cinética da reação.
Multiplex PCR, Nested PCR e ddPCR
A reação em cadeia da polimerase convencional no formato multiplex consiste na detecção simultânea de múltiplos alvos em uma mesma reação utilizando diversos iniciadores. O tamanho das bandas dos fragmentos gerados pelo produto amplificado denominado amplicon visualizado sob luz ultravioleta, após eletroforese em gel de agarose com coloração de brometo de etídio ou outro intercalante de DNA como o gel red é o diferencial na detecção de cada vírus distinto. A outra variação da técnica chamada Nested PCR ocorre quando um segundo par de oligonucleotídeos anela nas regiões internas do produto da primeira reação a fim de aumentar a sensibilidade e especificidade do método (Santos, 2015). A sigla ddPCR, do inglês Droplet Digital Polymerase Chain Reaction, traduzida como PCR digital em gotas permite a quantificação de reações mais robustas utilizando protocolos de enzimas de restrição específicos com diferentes aplicações em eventos de edição genômica.
Amplificação por círculo rolante
O genoma de novos vírus DNA como poliomavírus e papilomavírus humano têm sido caracterizados pela técnica de amplificação por círculo rolante (rolling circle amplification – RCA), que utiliza oligonucleotídeos randômicos e a enzima polimerase do fago com atividade proofreading para a síntese de novas fitas. Após a circularização do genoma, os produtos amplificados podem ser digeridos por endonucleases de restrição, clonados e posteriormente sequenciados para caracterização genômica (Santos, 2015).
3D Cell -SELEX
Aptâmeros são pequenas moléculas de DNA ou RNA sintetizadas quimicamente selecionadas in vitro pela técnica SELEX, do inglês Systematic Evolution of Ligands by Exponencial Enrichment que apresentam uma estrutura tridimensional. Essas moléculas possuem alta especificidade e afinidade contra alvos de interesse podendo atuar como nanopartículas em estudos oncológicos ou mesmo marcados para detecção de focos infecciosos em infecções pós-cirúrgicas. Diversos modelos de estudos selecionam e caracterizam os aptâmeros considerados análogos dos anticorpos monoclonais, como sendo candidatos promissores para diversas aplicações terapêuticas em infecções virais. Essa nova técnica é a combinação das culturas de células em 3D com a seleção de sequências curtas de oligonucleotídeos a partir de uma biblioteca de ligantes específicos no reconhecimento de alvos terapêuticos (Sousa, 2016).
DNA Microarray
Antes mesmo das análises de expressão gênica em larga escala, já existiam outras técnicas envolvidas na análise de transcritos descritos como EST, do inglês expressed sequence tags e SAGE, serial analysis of gene expression. Tais técnicas foram substituídas gradativamente para o microarranjo de DNA (DNA microarray) com a utilização de sondas curtas ou longas que hibridizavam com determinados transcritos conhecidos para a genotipagem ou na detecção de vírus respiratórios, por exemplo (Kremer, 2019). A partir da secreção respiratória de um paciente portador da síndrome respiratória aguda grave (SARS) foi possível caracterizar pelo ensaio de DNA microarray o vírus SARS-CoV isolado em culturas de células Vero (Santos, 2015). Outros estudos empregam o microarray na identificação de sequências de peptídeos e mutações correspondentes aos pacientes portadores do câncer de mama.
RNA-sequencing
O RNA-sequencing (RNA-seq) é uma técnica que analisa a quantidade de sequências de RNAs em uma amostra usando a plataforma NGS. Em outras palavras, a análise do transcriptoma destina-se ao perfil de todos os RNAs, incluindo mRNA, rRNA e tRNA para mensurar a expressão de genes simultaneamente (expressão gênica diferencial), capaz de identificar os genes que estão sendo mais expressos (up regulated) ou menos expressos (down regulated) em um determinado momento dos processos biológicos (Kremer, 2019).
Sequenciamento e NGS
Após a quantificação dos produtos de PCR purificados com o kit GFX PCR DNA purification (GE Healthcare), cerca de 5µL foram usados para a reação de sequenciamento usando o protocolo Big Dye (Applied Biosystems, USA). O cromatograma foi visualizado usando o software Cimarron. A qualidade das sequências obtidas foi avaliada pelo programa Chromas e/ou Biological Sequence Alignment Editor (BioEdit), e analisadas com as sequências do banco de dados Gen Bank pelo programa Basic Local Alignment Search Tool Program (Blast) para posterior construção da árvore filogenética (Simões & Barth, 2017). Em experimentos com clonagem, cerca de 500ng de DNA plasmidial são utilizados para a reação de sequenciamento convencional.
O método de sequenciamento descrito por Sanger vem sendo substituído por novas tecnologias designadas Next Generation Sequencing – NGS, no estudo das sequências genômicas. Atualmente existem diversas plataformas como o pirossequenciamento (Roche Applied Sciences) muito empregadas para estudo de subpopulações do vírus da hepatite C (HCV). Outros sistemas são Ion Torrent, Illumina, LiDia-SEQ, Lasergen, QuantuMDx e GenapSys Sequencing para amplificação clonal.
Clonagem
O avanço de técnicas que permitiram a manipulação do DNA revolucionou a biologia molecular. A clonagem é uma técnica que consiste em isolar um fragmento de DNA e inserir em outra célula hospedeira, com capacidade de replicação independente resultando em uma molécula de DNA recombinante. Geralmente o isolamento e a caracterização de genes específicos têm sido inseridos em vetores plasmidiais. Conceitualmente, plasmídeo é um DNA circular extracromossômico presente em bactérias contendo genes de resistência a determinados antibióticos. O plasmídeo recombinante carreando o gene de interesse é inserido em uma bactéria transformada após sofrer o processo de choque térmico ou eletroporação. O sucesso das clonagens pode ser conferido com as enzimas de restrição também chamadas de endonucleases que funcionam como tesouras genéticas com capacidade de reconhecer e clivar sítios específicas do DNA.
CRISPR
Pequenas regiões de DNA bacterianos repetidas e interespaçadas denominada CRISPR, do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats permite editar o DNA em regiões específicas. O sistema PAC-MAN CRISPR-CAS-13 (prophylactic antiviral CRISPR in human cells) tem sido desenvolvido como uma estratégia profilática antiviral contra o novo coronavírus, SARS-CoV-2 (Abbott et al., 2020).
Sobre a autora: Rachel Siqueira de Queiroz Simões é Pós-doutora pelo Programa de Medicina Tropical do Instituto Oswaldo Cruz e pelo programa de Engenharia Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Atualmente encontra-se lotada no Laboratório Interdisciplinar de Pesquisas Médicas vinculada ao Centro de Desenvolvimento Tecnológico em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz. Doutora em Ciência Animal e Mestre em Produção Animal pela Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Médica-Veterinária formada pela mesma instituição. Possui pós-graduação lato sensu em Biotecnologia pela Universidade Estadual do Maringá e especialização em Ética Aplicada e Bioética pelo Instituto Nacional de Saúde da Mulher, da Criança e do Adolescente Fernandes Figueira
Referências
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Kimura, L.M.S., Junior, J.V.D. Raiva. In: Virologia Humana e Veterinária. Simões, R.S.Q (ed). Thieme Revinter: Rio de Janeiro, p: 305-316, 2019.
Kremer, F.S. Análise de expressão gênica diferencial com RNA-seq (reference-guided). Omixdata, 2019.
Santos, N.S.O. Diagnóstico Laboratorial das Viroses. In: Virologia Humana. 3ed. Santos, N.S.O., Romanos, M.T.V., Wigg, M.D (Eds). Guanabara Koogan: Rio de Janeiro, p: 101-140, 2015.
Simões, R.S.Q., Barth, O.M. Papillomavirus (PV)-associated skin diseases in domestic and wild animals: animal nucleotide sequence identity of PV types to their closest related PV and HPV sequences deposited in the gen bank. International Journal of current microbiology and applied sciences, 6:938-951, 2017.
Simões, R.S.Q. et al. HPV DNA detection: Prevalence in sexually active women from Manguinhos, Rio de Janeiro State. Virus Reviews and Research, 21:14-15, 2016.
Simões, R.S.Q et al. Transient transfections of human cell lines HEK-293-T and HuH7 for production of HBsAg/HCV Chimeric protein: comparative detection using the Elisa and Western Blotting. Virus Reviews and Research, 16:111-112, 2011.
Sousa, A.G et al. 3D Cell-SELEX: Development of RNA aptamers as molecular probes for PC-3 tumor cell line. Experimental Cell Research, 2016, http://dx.doi.org/10.1016/j.yexcr.2016.01.015
[[Artigo disponível na íntegra na Revista Newslab Ed 160]]
