A Cromatografia Líquida por Interação Hidrofílica (HILIC – Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) é uma técnica cada vez mais utilizada na separação de compostos polares e altamente hidrofílicos, que apresentam baixa retenção ou são mal resolvidos por HPLC de fase reversa. Baseada em mecanismos similares à cromatografia de fase normal, mas utilizando fases móveis majoritariamente aquosas e compatíveis com HPLC convencional e espectrometria de massas (MS), a HILIC oferece uma alternativa poderosa para análises de metabólitos, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos e outros analitos polares.
Este artigo apresenta os fundamentos da HILIC, seus componentes principais, mecanismos de retenção, vantagens, limitações e principais aplicações.
1. Fundamentos da Cromatografia HILIC
A HILIC é uma técnica que combina elementos da cromatografia de fase normal com a compatibilidade operacional da fase reversa.
- A fase estacionária: É polar, como sílica desnuda, diol, amino, ciano ou zwitteriônica.
- A fase móvel: É predominantemente orgânica (geralmente acetonitrila) com uma porção aquosa (10–40%) contendo tampão ou aditivos iônicos.
A separação ocorre por interação entre os analitos polares e uma camada aquosa imobilizada na superfície da fase estacionária polar, criando um sistema de partição entre a fase móvel rica em acetonitrila e essa pseudo-fase estacionária aquosa.
2. Mecanismo de Retenção
A retenção em HILIC se dá por uma combinação de mecanismos, com predominância da partição hidrofílica:
- Partição polar dos compostos mais polares interagem com a camada aquosa da fase estacionária e são mais retidos.
- Interações eletrostáticas entre analitos ionizados e grupos funcionais da fase estacionária.
- Ligações de hidrogênio e interações dipolo-dipolo complementam a seletividade.
A retenção aumenta com o aumento da concentração de acetonitrila na fase móvel, ao contrário do que ocorre na RP-HPLC.
3. Componentes e Condições Cromatográficas
3.1. Fase Estacionária
- Sílica desnuda (SiOH)
- Diol
- Amino ou ciano (NH₂, CN)
- Zwitteriônicas (PC, sulfobetainas)
3.2. Fase Móvel
- Alta porcentagem de acetonitrila (60–90%)
- Adição de água ou tampão aquoso (10–40%), geralmente contendo NH₄OAc ou NH₄FA
- pH ajustado de acordo com a ionização dos analitos (geralmente entre 3 e 7)
4. Aplicações da HILIC
4.1. Bioanálises e Metabolômica
- Análise de aminoácidos, nucleotídeos, açúcares, fosfatos e metabólitos polares
- Compatível com MS (alta eficiência e baixa supressão iônica)
4.2. Indústria Farmacêutica
- Impurezas polares de fármacos
- Substâncias altamente hidrofílicas não retidas por RP-HPLC
- Determinação de compostos de degradação hidrossolúveis
4.3. Alimentos e Bebidas
- Açúcares, álcoois polares, vitaminas solúveis em água
- Compostos com grupos polares como polifenois e alcaloides
4.4. Análises Ambientais
• Resíduos de herbicidas e pesticidas polares
• Contaminantes emergentes e solúveis em água
5. Vantagens da HILIC
- Excelente retenção e separação de compostos altamente polares
- Alta compatibilidade com detectores por espectrometria de massas (MS)
- Uso eficiente de acetonitrila (alta transparência UV e baixa viscosidade)
- Boa seletividade complementar à fase reversa
- Pode ser usada como abordagem ortogonal em validações analíticas
6. Limitações e Cuidados Específicos
- Requer tempo de equilíbrio maior que RP-HPLC
- Sensível à composição exata da fase móvel (influência forte de % de água e tampão)
- Alguns analitos muito polares ainda apresentam baixa retenção
- Interações múltiplas podem dificultar a reprodutibilidade e robustez do método
- As colunas HILIC não são todas equivalentes – fase estacionária deve ser selecionada com base na natureza do analito
7. Quando Utilizar a HILIC?
Conclusão
A HILIC preenche uma lacuna crítica deixada pela cromatografia de fase reversa, oferecendo retenção e resolução superiores para compostos altamente polares. Sua capacidade de operar com altos teores de acetonitrila e sua compatibilidade com MS fazem dela uma ferramenta poderosa em bioanálises, farmacêutica e controle de qualidade de substâncias hidrossolúveis.
Compreender os mecanismos de retenção e os parâmetros críticos da HILIC é essencial para o desenvolvimento de métodos robustos e eficientes. Quando aplicada corretamente, a HILIC amplia significativamente a capacidade de separação e análise de compostos em matrizes complexas.
Referências Bibliográficas
- Hemstrom, P., & Irgum, K. (2006). Hydrophilic interaction chromatography. Journal of Separation Science.
- McCalley, D. V. (2010). Practical applications of hydrophilic interaction chromatography (HILIC). Journal of Chromatography A.
- Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Introduction to Modern Liquid Chromatography. Wiley.
- United States Pharmacopeia (USP). Chapter <621> Chromatography.
- ICH Q2(R1). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.
AUTOR:
Edwin Bueno é engenheiro químico e especialista em cromatografia, com mais de 13 anos de experiência no desenvolvimento de métodos analíticos. Atualmente é diretor técnico da Atuallabs e consultor técnico de grandes indústrias, dedica-se a otimizar processos, garantir a qualidade analítica e disseminar boas práticas laboratoriais, contribuindo para a excelência do setor.