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HILIC – Conceitos e Aplicações

HILIC – Conceitos e Aplicações

A Cromatografia Líquida por Interação Hidrofílica (HILIC – Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) é uma técnica cada vez mais utilizada na separação de compostos polares e altamente hidrofílicos, que apresentam baixa retenção ou são mal resolvidos por HPLC de fase reversa. Baseada em mecanismos similares à cromatografia de fase normal, mas utilizando fases móveis majoritariamente aquosas e compatíveis com HPLC convencional e espectrometria de massas (MS), a HILIC oferece uma alternativa poderosa para análises de metabólitos, açúcares, aminoácidos, nucleotídeos e outros analitos polares.

Este artigo apresenta os fundamentos da HILIC, seus componentes principais, mecanismos de retenção, vantagens, limitações e principais aplicações.

1. Fundamentos da Cromatografia HILIC

A HILIC é uma técnica que combina elementos da cromatografia de fase normal com a compatibilidade operacional da fase reversa.

  • A fase estacionária: É polar, como sílica desnuda, diol, amino, ciano ou zwitteriônica.
  • A fase móvel: É predominantemente orgânica (geralmente acetonitrila) com uma porção aquosa (10–40%) contendo tampão ou aditivos iônicos.

A separação ocorre por interação entre os analitos polares e uma camada aquosa imobilizada na superfície da fase estacionária polar, criando um sistema de partição entre a fase móvel rica em acetonitrila e essa pseudo-fase estacionária aquosa.

2. Mecanismo de Retenção

A retenção em HILIC se dá por uma combinação de mecanismos, com predominância da partição hidrofílica:

  • Partição polar dos compostos mais polares interagem com a camada aquosa da fase estacionária e são mais retidos.
  • Interações eletrostáticas entre analitos ionizados e grupos funcionais da fase estacionária.
  • Ligações de hidrogênio e interações dipolo-dipolo complementam a seletividade.

A retenção aumenta com o aumento da concentração de acetonitrila na fase móvel, ao contrário do que ocorre na RP-HPLC.

3. Componentes e Condições Cromatográficas

3.1. Fase Estacionária

  • Sílica desnuda (SiOH)
  • Diol
  • Amino ou ciano (NH₂, CN)
  • Zwitteriônicas (PC, sulfobetainas)

3.2. Fase Móvel

  • Alta porcentagem de acetonitrila (60–90%)
  • Adição de água ou tampão aquoso (10–40%), geralmente contendo NH₄OAc ou NH₄FA
  • pH ajustado de acordo com a ionização dos analitos (geralmente entre 3 e 7)

4. Aplicações da HILIC

4.1. Bioanálises e Metabolômica

  • Análise de aminoácidos, nucleotídeos, açúcares, fosfatos e metabólitos polares
  • Compatível com MS (alta eficiência e baixa supressão iônica)

4.2. Indústria Farmacêutica

  • Impurezas polares de fármacos
  • Substâncias altamente hidrofílicas não retidas por RP-HPLC
  • Determinação de compostos de degradação hidrossolúveis

4.3. Alimentos e Bebidas

  • Açúcares, álcoois polares, vitaminas solúveis em água
  • Compostos com grupos polares como polifenois e alcaloides

4.4. Análises Ambientais

• Resíduos de herbicidas e pesticidas polares

• Contaminantes emergentes e solúveis em água

5. Vantagens da HILIC

  • Excelente retenção e separação de compostos altamente polares
  • Alta compatibilidade com detectores por espectrometria de massas (MS)
  • Uso eficiente de acetonitrila (alta transparência UV e baixa viscosidade)
  • Boa seletividade complementar à fase reversa
  • Pode ser usada como abordagem ortogonal em validações analíticas

6. Limitações e Cuidados Específicos

  • Requer tempo de equilíbrio maior que RP-HPLC
  • Sensível à composição exata da fase móvel (influência forte de % de água e tampão)
  • Alguns analitos muito polares ainda apresentam baixa retenção
  • Interações múltiplas podem dificultar a reprodutibilidade e robustez do método
  • As colunas HILIC não são todas equivalentes – fase estacionária deve ser selecionada com base na natureza do analito

7. Quando Utilizar a HILIC?

Conteúdo do artigo

Conclusão

A HILIC preenche uma lacuna crítica deixada pela cromatografia de fase reversa, oferecendo retenção e resolução superiores para compostos altamente polares. Sua capacidade de operar com altos teores de acetonitrila e sua compatibilidade com MS fazem dela uma ferramenta poderosa em bioanálises, farmacêutica e controle de qualidade de substâncias hidrossolúveis.

Compreender os mecanismos de retenção e os parâmetros críticos da HILIC é essencial para o desenvolvimento de métodos robustos e eficientes. Quando aplicada corretamente, a HILIC amplia significativamente a capacidade de separação e análise de compostos em matrizes complexas.

Referências Bibliográficas

  • Hemstrom, P., & Irgum, K. (2006). Hydrophilic interaction chromatography. Journal of Separation Science.
  • McCalley, D. V. (2010). Practical applications of hydrophilic interaction chromatography (HILIC). Journal of Chromatography A.
  • Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Dolan, J. W. (2011). Introduction to Modern Liquid Chromatography. Wiley.
  • United States Pharmacopeia (USP). Chapter <621> Chromatography.
  • ICH Q2(R1). Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.

 

AUTOR:

Edwin Bueno é engenheiro químico e especialista em cromatografia, com mais de 13 anos de experiência no desenvolvimento de métodos analíticos. Atualmente é diretor técnico da Atuallabs e consultor técnico de grandes indústrias, dedica-se a otimizar processos, garantir a qualidade analítica e disseminar boas práticas laboratoriais, contribuindo para a excelência do setor.